课题3　血红蛋白的提取和分离.ppt

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1、专题5DNA和蛋白质技术思考：1、血红蛋白为什么呈现红色？2、一分子血红蛋白可携带几分子O2？3、一分子血红蛋白可携带几分子CO2？血红蛋白1.蛋白质分离的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念：3.凝胶

2、色谱法的原理①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？（二）缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。1.作用:2.缓冲溶液的配制:通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓

3、冲液。3.在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？（三）电泳：1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向电场作用

4、力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√聚丙烯酰胺凝胶电泳1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。2.原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条

5、肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS作用机理:二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团血液有哪些成分？用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核

6、，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：（1）洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色其他血细胞1.样品处理和粗分离：（二）操作过程(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作：1

7、、采集血样。2、低速短时间离心3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤(生理盐水)。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）（2）释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是_________