酶联免疫吸附实验.ppt

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1、【实验内容】实验八ELISA(双抗体夹心法测定HBsAg)一、免疫标记技术（一）免疫标记技术：即用酶、同位素、荧光素、发光物质等标记技术代替传统的肉眼可见反应，其特异性、敏感性均增加，且可以定性、定量甚至定位；缺点是某些技术需特殊精密检测仪。（二）免疫酶标技术：用酶标记的已知抗原（或抗体）来检测未知的抗体（或抗原）的一种免疫学标记技术。它同时利用了酶的高效催化效能及Ag-Ab反应的高度特异性；据底物被酶分解后的显色及深浅可反映待测样品中Ag、Ab的有无与含量；故可以定性、定量或定位（免疫组化）。（一）定义：是固相吸附技术与免疫酶技术的

2、结合，具有特异性高、敏感性强、稳定性好、操作简便等优点，是当前应用最广的一类酶免疫测定法。其中固相免疫技术即将抗原或抗体用物理方法连接在固相上形成免疫吸附剂。（二）常用的实验材料固相吸附剂：聚苯乙烯、NC膜酶：HRP（辣根过氧化物酶）、AKP（碱性磷酸酶）底物：OPD（邻苯二胺）、DAB（二胺基联苯胺）、TMB（四甲基联苯胺）二、ELISA（酶联免疫吸附试验）间接法双抗夹心法抗原竞争法间接法双抗体夹心法抗原竞争法包被物AgAbAb酶标物Ab2(抗抗体)AbAg待测物Ab1(一抗)多价大分子抗原抗原、半抗原、抗体（三）原理与方法1、间接

3、法2、双抗体夹心法3、竞争法实验材料——微量加样器、板洗涤2次洗涤2次洗涤3次（已做）抗体包被（4℃过夜）加待测血清及对照液（37℃孵育30′）加底物显色（37℃孵育10min）,终止酶反应，肉眼观察或于酶标仪中测OD值加酶标抗体（37℃孵育30′）三、双抗体夹心法测定HBsAg（一）实验流程包被抗体：羊抗人HBsAg的抗体酶标抗体：HRP-羊抗人HBsAg的抗体底物：OPD（邻苯二胺）终止液：2MH2SO4洗涤：每孔加满洗涤液后，静置3-5分钟后甩去扣干；重复3次加样及量：待测血清及阳性和阴性对照各3孔／组除终止液0.05ml／孔外

4、，均为0.1ml／孔（二）实验材料及方法