实验酶联免疫吸附测定

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1、酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）免疫学教研室抗原-抗体反应的基本检测方法凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。补体参与的反应免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:用示踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。基础医学院免疫学教研室用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。免疫标记技术基础医学院免疫学教研室用FITC-抗IgM单抗计

2、数B细胞免疫荧光技术基础医学院免疫学教研室课程内容ELISA的原理ELISA的分类间接ELISA的具体操作ELISA在医学中的应用实例基础医学院免疫学教研室酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA)酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)原理：将抗原（抗体）固相化，与酶标记的相应抗体（抗原）结合后，加入该酶作用的底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。方法：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA等基础医学院免疫学教研室ELIS

3、A的原理1.抗原抗体反应的特异性2.抗原或抗体的固相化3.抗原或抗体的酶标记E基础医学院免疫学教研室ELISA的分类（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）竞争法基础医学院免疫学教研室直接ELISA酶标一抗基础医学院免疫学教研室间接法的原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。可用于传染病的诊断。间接法（测抗体）基础医学院免疫学教研室夹心ＥＬＩＳＡ（检测抗原）只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白

4、质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。基础医学院免疫学教研室竞争抑制法（检测抗原）待检抗原与标记抗原竞争结合抗体。小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。基础医学院免疫学教研室washTMB标准HBcAg标准酶标HBcAbwash待检HBcAb当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；基础医学院免疫学教研室间接ELISA实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料

5、：包被抗原：小鼠血清待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG聚苯乙烯酶标板水浴箱移液器枪头包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)稀释液/稀：pH7.40.05M的PBS（磷酸盐缓冲液）洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20）显色液：OPD（邻苯二胺）终止液/终：2M硫酸鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驴抗兔IgG(二抗)免疫Fc段基础医学院免疫学教研室操作步骤包被：正常小鼠血清（IgG）包被，100μl/孔，4℃过夜封闭：弃去包被液，加入5%脱脂奶粉封闭（200μl/孔），37℃,20min弃去封闭

6、液，用洗涤缓冲液（PBS/Tween20）洗板3次加入一抗：加入不同稀释度的兔抗鼠IgG血清（100μl/孔），以200×起始，空白对照孔用洗液代替，37℃,20min洗板3次加入酶标二抗：加入HRP-驴抗兔抗体（100μl/孔），37℃,20min洗板3次显色：加入底物,100μl/孔。室温避光显色5-10min;2MH2SO4终止反应结果判定间接ELISA基础医学院免疫学教研室→→→EE→终止液终止显色A,B两排同样操作，每孔加１００ul!包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清，37℃15min加

7、待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37℃15min洗涤：3次，1min/次封闭：5%脱脂奶粉，37℃20min终止液50ul空白对照无显色加底物液显色底物液100ul→洗涤：3次，1min/次洗涤：3次，1min/次基础医学院免疫学教研室A,B排上样完全相同：复孔AB1234567891011122-12号每孔１00uL稀释液，１号孔加入200uL一抗，从１号孔吸取100uL加到２号孔中，混匀，从２号孔吸取100uL加到３号孔中，混匀，．．．．．１１号孔吸取１００uL，丢弃！每孔终体积100uL无Ab,仅稀释液基础医学院免疫学教研室病原微生物及