酶联免疫吸附测定

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1、酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）www.themegallery.comCompanyLogo抗原-抗体反应的特点与影响因素反应条件：自身因素:环境因素:适宜温度电解质酸碱度特点：特异性可逆性最适比例www.themegallery.comCompanyLogo凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。补体参与的反应免疫标记技术（immunolabellingtechnique）:用示踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。抗原-

2、抗体反应的基本检测方法www.themegallery.comCompanyLogo用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。用FITC-抗IgM单抗计数B细胞免疫荧光技术www.themegallery.comCompanyLogo课程内容ELISA的原理ELISA的分类间接ELISA的具体操作ELISA在医学中的应用实例www.themegallery.comCompanyLogoELISA的原理1.抗原抗体反应的特异性2.抗原或抗体的固相化3.抗原或抗体的酶标记Ewww.themegallery.comCompanyLogo

3、间接ELISA实验目的：小鼠IgG免疫兔，检测兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价实验材料：包被抗原：小鼠血清待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG聚苯乙烯酶标板水浴箱移液器枪头包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液封闭液/封：5%脱脂奶粉(ALB)稀释液/稀：pH7.40.05M的PBS（磷酸盐缓冲液）洗液：PBST（PBS+0.05%吐温20）显色液：四甲替联苯胺(TMB)终止液/终：2M硫酸阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驴抗兔IgG(二抗)免疫兔免疫驴www.themegallery.comCompanyLog

4、o操作步骤包被：1：2000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜封闭：5%脱脂奶粉，37℃，20min加待检抗体：倍比稀释兔抗鼠IgG抗血清，37℃15min加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清(已稀释好)，37℃15min加底物液显色→→→→洗涤：3次，1min/次洗涤：3次，1min/次洗涤：3次，1min/次→终止液终止显色（黄）空白对照无显色待测样品显色明显(蓝)EEEE底物液底物、终止液加50ul／孔封一抗二抗无色避光从此步开始本次实验！www.themegallery.comCompanyLogo倍比稀释法与加样除第一列孔外，先在其余每孔加100ul稀释液(

5、稀)；在第一列孔加入200ul一抗；取100ul加入第二列孔，混匀从第二列孔取100ul液体至第三列孔；。。。。。。AB123456789101112blank每孔终体积为100ul,上下两排一致一抗1:5001:1000…….1:2000100µL100µL100µLwww.themegallery.comCompanyLogoELISA的分类（一）直接法（二）间接法（三）双抗体夹心法（四）竞争法www.themegallery.comCompanyLogo（一）直接法www.themegallery.comCompanyLogo间接法的原理为利用酶标记的二抗以检测已与固相结合的受检

6、一抗，故称为间接法。其优点在于只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应一抗的方法。可用于传染病的诊断。（二）间接法（测抗体）酶标二抗一抗AgwashBSAwashwashTMB血清www.themegallery.comCompanyLogo（三）双抗体夹心法（测抗原）只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶标Ab而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。包被Ab酶标AbAgTMBwashwashwash血清www.themegallery.comCompanyLogo（四）竞争法（HBcAb）当抗原材料中的干

7、扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体；如HBeAb，HBcAb；小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。washTMBHBcAg酶标HBcAbwashHBcAb血清www.themegallery.comCompanyLogo病原微生物及其抗体检测如:肝炎病毒,SARS等临床疾病诊断中的应用蛋白质测定:各种免疫球