实验十一__酶联免疫吸附测定

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1、实验十一酶联免疫吸附测定（ELISA）一、原理酶联免疫吸附法(ELISA，enzyme-linkedimmunosorbentassay)是一种利用免疫学原理检测抗原或抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液—液抗原—抗体反应体系不同之处是建立了固—液抗原—抗体反应体系，并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检出1pa的目的物；同时酶反应还具有很强的特异性。除了可溶性抗原(抗体)之外，ELISA还可以检测含表面抗原的细胞。因此，ELISA是基因

2、表达研究中不可缺少的方法。通过表达蛋白的定量测定，可以研究外源基因在转基因植株中的表达活性、外源基因在转基因植株中表达的器官组织特异性和外源基因在转基因植物中的表达调控。ELISA检测程序包括抗体制备、抗体或抗原的包被、免疫反应及检出三个阶段，现将这三个阶段的有关原理及操作介绍如下：（一）抗体的制备抗体是机体应抗原刺激产生的一组特殊的球蛋白，以Iｇ表示。无脊椎动物不产生免疫球蛋白；两栖类产生IgM、IgG；家兔产生IgM、IgG、IgA；人类出现IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，其中IgG是主要

3、的，占总量的75％，分子量为160kDa。ELISA检测中涉及到的抗体有两种，一种是未标记的抗体，另一种是酶标记的抗体。酶标记的抗体又有两种情况，第一种是针对特异抗原的酶标一抗，第二种是针对一抗的酶标二抗。酶标抗体制备包括通过免疫过程制备抗体及对所获的抗体进行酶标记两大步骤。1．通过免疫反应制备抗体1)抗原制剂的制备要获得优质抗体，使用的抗原必须具有较强的免疫原性并应经过纯化。完全抗原具免疫原性(刺激机体产生一系列免疫反应)及反应原性(与抗体发生特异性反应)。如果只有反应原性而缺少免疫原性或免疫原性不

4、完善，则称不完全抗原或半抗原。需要用半抗原进行免疫反应时，应将半抗原与一些免疫原性强的蛋白质，如BSA、γ—球蛋白等(这些蛋白质称为载体蛋白)进行化学偶联，或通过戊二醛作用使二者交联形成多聚体，这样均可提高其免疫原性。免疫时，需将抗原制备成抗原制剂。制备抗原制剂常使用免疫佐剂。可溶性抗原经佐剂乳化后注射，佐剂—抗原的乳化物在动物机体内逐步释放，可延长抗原在机体内的存留时间，便于抗原在较长时间里不间断地刺激机体免疫系统，提高抗体效价。另外佐剂中含有激活巨噬细胞等生理活性的卡介苗类物质，可提高抗原的免疫原

5、性。常用的佐剂是福氏佐剂，成分是1份羊毛脂+5份石腊油混合后加入3-4mg／m1的卡介苗，此为完全福氏佐剂，不加入卡介苗的为不完全福氏佐剂。2)免疫反应抗体是通过免疫反应产生的。免疫反应是机体在抗原刺激下产生的体液免疫(体液抗体)和细胞免疫(效应淋巴细胞)的过程。这一过程依赖于抗原的特定的化学结构(抗原决定簇)及动物机体的免疫反应能力(抗原免疫原性)。动物机体免疫反应能力除受遗传因素控制外，还与机体的生理状态、抗原进入机体的途径、佐剂的使用等因素有关，因此制备抗体时这些因素都应在考虑之内。同一抗原对不

6、同种动物、同种但不同品系的动物、甚至不同的个体，产生特异免疫反应的强弱都可能不同。因此，必须选择对该抗原敏感的动物进行免疫。最常用的动物是家兔，此外还有山羊、鼠、鸡、马等。抗体的产生需要一个过程。第一次免疫时产生抗体的水平低，并不持久，其主要成分是IgM，需进行再次免疫。当抗原第二次进入体内时，体内的抗体迅速与抗原结合，因而在开始时体内抗体水平下降，一两天后抗体水平又显著上升，并在短时内达到高峰。该高峰水平高于第一次免疫，此抗体水平可维持数月，其主要成分是IgG。如再注射一次，抗体水平可再提高，直到不

7、能再继续增高为止。此做法称为加强免疫。注意，要获得最大的免疫反应，第一次和第二次抗原注射之间的时间间隔不能太短，一般在3～6周。免疫途径有耳静脉、淋巴结、肌肉、皮下、皮内等注射。最简单而且也是最常用的是多点注射：将抗原—佐剂的混合液注射到动物皮内或皮下的多个位点内，其优点是第一次免疫反应快，抗体效价高，需要加强免疫的次数少。3)抗血清制备抗血清是指含有某种特异抗体的动物血清。在加强免疫7～10d后可从耳缘静脉或直接穿刺心脏取血，静置，离心，上层血清即为抗血清。由于抗原与抗体反应具有高度的特异性，因而有

8、时抗血清往往可不经纯化，直接用于检测。4)抗体的纯化抗体有5大类。抗体纯化有两个含义：一种是指抗体类别的纯化，如从抗血清中纯化出IgG类；另一种是指从该类中除去与相应抗原无关的抗体成分。制备酶标抗体时，往往需要从抗血清中纯化出IgG，IgG在免疫球蛋白中约占75％一80％。从抗血清中制备IgG第一步多采用50％饱和度的硫酸铵盐析，沉淀出丁—球蛋白(主要成分是IgG)，经透析或用SephadexG50凝胶柱层析去盐后得粗提的丫—球蛋白溶液，然后再进行纯化。