组织制片技术概述.ppt

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1、组织制片技术主讲：张端莲组织制片的意义和目的组织标本制作的方法组织切片标本制作的基本程序苏木精—伊红染色的程序组织制片的意义和目的组织制片技术是随着生命科学的发展而不断进步的。利用组织切片染色(staining)的方法所制出的标本显示了各种组织细胞的不同结构和形态，它们之间的相互连接及它们之中的某些化学成分的种类和含量的变化，为细胞分子学的研究提供了最直观的依据。因此组织制片是研究医学和生物学的一个最基本和最重要的手段组织标本制作的方法组织切片法非组织切片法组织切片法利用化学试剂将组织经过一系列的固定(fixation)、脱水、透明后，再利用石蜡或火棉胶和明胶等支持物渗透进组织内部，使组织

2、保持一定的硬度，并包埋(embedding)成块，然后依靠切片机(microtome)将包埋好的组织块切成以微米计的薄片，再根据需要进行各种染色得到的供显微镜下观察的标本的方法。石蜡切片、火棉胶切片、明胶切片冰冻切片非组织切片法组织不经过切片手续制成的观察标本的方法为非组织切片法。包括：涂片、压片、铺片、磨片、消化分离、活体标本、整装标本、血管注射标本。涂片将所采的血液或骨髓样品涂抹于载玻片上经瑞氏或姬姆萨染色后的标本。压片先将组织处理成小块物质，然后经化学药品软化和染色，再用盖玻片压封于载玻片上的标本。例如运动终板等。铺片将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上，然后经过固定、染

3、色等程序制成的标本。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。磨片骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上的标本。消化分离将组织分离成小块，然后利用相应的化学药品水溶液将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方法，如利用水的震荡冲击力等，使小块组织分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上封固的标本。例如平滑肌分离标本，脊髓的运动神经细胞等。活体标本将所采的观察标本加生理盐水后直接滴于载玻片上在显微镜下观察。整装标本一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经

4、固定、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。血管注射标本一种是将有色物质注射进血管，用酸或硷将血管周围的组织腐蚀后做成的整体封藏的血管标本。另一种是将有色物质注射进血管后，经一系列制片技术处理后封固于载玻片上供显微镜下观察的标本。组织切片标本制作的基本程序:取材—固定—固定后处理—脱水—透明—浸蜡—包埋—切片—染色—封固取材动物的处死处死动物要求手法迅速、快捷，避免动物因过度痛苦而产生组织细胞的变化。处死动物的几种常用方法：麻醉法空气栓塞法击头法颈椎脱臼法破坏脑和脊髓股动脉放血取材的方法：选择动物选择取材部位选择切面方向根据实验工作的目的选择动物取材应根据实验工作的目的选择动物的种类、组

5、织部位和材料大小。肝脏—猪肝卵巢—猫胃—狗运动终板—爬虫类动物肥大细胞—大、小白鼠的皮下组织间皮和内皮—蛙的肠系膜铺片最好根据器官组织的结构特点选择部位：胰腺—胰尾部脊髓的运动神经元—颈膨大和腰膨大处肺—肺门胃—胃底部根据器官组织的结构特点选择切面方向肾脏—肾门处作纵切头皮—顺毛根的方向纵切大小肠的环行皱襞—纵切气管和食管—横切应注意的问题：组织新鲜注意环境温度的影响材料应小而薄1．5×1．5×0．5厘米3防止组织变形防止组织损害防止组织污染固定和固定剂固定的目的：防止组织细胞产生自溶和腐败使细胞易于着色使组织适度硬化固定的方法：直接固定蒸汽固定灌注固定：局部灌注固定全身灌注固定。固定的注

6、意事项：固定剂的用量一般为组织块体积的15倍左右固定剂的配制现配现用最为理想还原剂（如甲醛）尽量不要与氧化剂（如重铬酸钾）配伍固定的时间一般情况下固定24小时既可达到固定要求。固定后处理：流水冲洗脱黄脱汞脱甲醛色素组织漂白脱钙（酸溶液脱钙、螯合脱钙、电解脱钙）固定剂单纯固定剂甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、重铬酸钾、丙酮、铬酸、四氧化锇混合固定剂中性甲醛液、乙醇—甲醛液、Bouin氏液、苦味酸—硫酸液、Carnoy氏液、Helly氏液甲醛(Formeldedhyde)固定浓度：10%--20%水溶液固定时间：12小时—24小时固定后处理：流水冲洗12小时—24小时配制方法：甲醛原液10m

7、l—20ml生理盐水（或蒸溜水）90ml—80ml特性：甲醛原液浓度为40%。甲醛放置时间过长易产生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后变为甲酸，使溶液变为酸性，严重时可影响到细胞核着色。因此需长期保存的甲醛溶液应加入适量的碳酸镁或碳酸钙作为中和剂。酸性甲醛固定的组织易产生甲醛色素，固定后须用硷性溶液洗涤乙醇(Ethylalcohol)固定浓度：80%--90%乙醇液固定时间：一般4小时—12小时固定后处理：直接入脱水剂配制方法