第03章 蛋白质的通性、纯化与表征.ppt

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1、第03章蛋白质的性质和分离纯化PropertiesandPurificationofProtein生物化学Biochemistry生命科学与技术学院陈吉宝蛋白质是一种两性电解质1、蛋白质的酸碱性质pH=6蛋白质份子表面分布着不同的电荷。蛋白质等电点：使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等时溶液的pH值为蛋白质的等电点（pI）。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小。由于①蛋白质表面极性基团形成的水化膜，②非等电状态时，同种电荷的互相排斥，③质点大小在

2、1-100nm，故蛋白质水溶液是胶体溶液。稳定蛋白质胶体溶液的主要因素①水化层(hydrationshell);②静电排斥：2、蛋白质的胶体性质与沉淀一旦电荷被中和或水化膜被破坏，在蛋白质的疏水作用下，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。蛋白质沉淀(precipitation)的方法③重金属盐沉淀法：pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子结成不溶性沉淀（Ca2+、Mg2＋、Ba2+、Pb2+与羧基结合；Mn2＋、Zn2＋、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ni2+与羧基、含氮化合物及杂环化合物结合；A

3、g+、Hg2+、Pb2+能与巯基结合）。重金属沉淀的蛋白质常是变性的。②有机溶剂沉淀法：与蛋白质份子争夺水分子，破坏蛋白质表面的水化膜，降低介电常数。使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇等。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。①盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。蛋白质不变性。④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电点时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：是指能引起

4、生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。⑤加热变性沉淀：将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，热稳定性差的蛋白质将发生变性而凝固沉淀。3、蛋白质的分离纯化蛋白质分离纯化的总目标：增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性）。3.1.1前处理(pretreatment)——释放蛋白质①将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理植物组织和细胞：石英砂+提取液、研磨、纤维素酶处理细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理②收集细胞的某一

5、组分：差速离心法③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。3.1一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存3.1.2粗分级(roughfractionation)——去杂质蛋白质和其它大分子一般用选择性沉淀法：①盐析（例如用(NH4)2SO4分级沉淀）；②等电点选择性沉淀法；③有机溶剂分级沉淀法；④热处理选择性沉淀法；⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法3.1.3细分级（finefractionation)——纯化①透析除盐；②凝胶过滤除盐；③层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲

6、和层析、疏水层析（反相HPLC）；④电泳法；⑤密度梯度离心。3.1.4浓缩与保存结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH等。冻干粉保存：在冷冻状态下让样品中的液体升华。溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20~-70℃保存。蛋白质分子的大小：透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤蛋白质溶解度：盐析、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀蛋白质电荷状况：凝胶电泳、等电聚焦、离子交换层析蛋白质吸附性质：羟基磷灰石吸附层析、疏水作用层析蛋白质生物学亲和性：亲和层析3.2常见蛋白质分离纯化的方法与原理

7、透析：半透膜阻留pro分子，而让小的溶质分子（无机盐）和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸，单糖等）。超滤：施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。1）透析和超滤2）凝胶过滤层析（GFC）Vt-Vo或Vi+VmVtVo分离介质:凝胶颗粒（交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖等），具有不均匀的网状结构分离机制：分子筛效应，即根据蛋白质分子大小不同来分离蛋白质，大分子物质最先流出柱外，小分子物质最后流出柱外。分配系数Kd可以把凝胶层析看成是液-液分配层析。固定相

8、是凝胶珠内部水相（Vi），流动相是凝胶外部水相（Vo）。Kd为样品在两相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部水和外部水中的分配系数，它只与被分离物分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的粗细长短无关，也就是说它对特定物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd=(Ve-Vo)/Vi在限定的层析条件下，Vt和Vo都为恒定值，Ve值是随着分离物分子质量的变化而变化的。分离物分子质量大，