第3章-蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

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1、Protein第3章蛋白质的分离纯化和表征蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳—带电粒子在电场中移动的现象。一、蛋白质的两性电离及等电点pI通常在6.0左右一、蛋白质

2、的两性电离及等电点二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidalsystem）胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质（二）蛋白质的沉淀Pr从胶体溶液中析出Ⅰ可逆沉淀：温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解——非变性沉淀pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等不可逆沉淀强烈

3、沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解——变性沉淀如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等Ⅱ1.盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（（NH4）2SO4）2.有机溶剂沉淀脱去水化层降低介电常数而增加带电质点间的相互

4、作用，减少蛋白质表面可解离基团的离子化程度3.等电点沉淀4.重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐5.生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐6.加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态一.分离纯化蛋白质的意义1.研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性；2.提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态；3.作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。二、蛋白质提纯的总目标：增加制品纯度或比活力，设法除去变性的蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质的产量达到最高值。三、蛋白质分离纯化的一般

5、原则三、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活1.前处理：因动/植物/细菌而异2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等4.结晶2、根据溶解度分等电点沉淀盐析（常用硫酸铵）有机溶剂沉淀3、根据电离性质分电泳离子交换层析1、根据分子大小分透析或超滤离心沉淀凝胶过滤层析4、特异亲和力：亲和层析沉降平衡离心法沉降速度离心法四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1、透析和超过滤利用蛋白

6、质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料凝胶过滤凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大.测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex（二）利用溶解度差别的纯化方法1.等电点沉淀调整溶液pH，不同蛋白在各自pI处依次沉淀2.盐溶和盐析2.盐析在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的

7、强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性3.有机溶剂分级分离法争夺水化膜降低介电常数电泳原理蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶

8、解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。水平式平板凝胶电泳垂直式平板凝胶电泳双向电泳蛋白质双向电泳离子交换层析六离子交换层析（七）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰