第7章 蛋白质的分离、纯化和表征

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1、第7章　蛋白质的分离、纯化和表征ProteinSeparation,PurificationandCharacterization因材施法，有的放矢ProteinPurificationandCharacterization对蛋白质分子进行的各种研究，要建立在对蛋白质分子本身的性质（特别是区别于其它生物与化学分子的独特的性质）和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。蛋白质大分子半透膜小分子透析袋外小分子透析袋内ProteinPurificationandCharacterization分离和纯化蛋白质的各种方

2、法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：分子的大小和形状酸碱性质溶解度吸附性质对配体分子的特异生物学亲和力ProteinPurificationandCharacterizationTheaimofproteinpurificationistoisolateoneparticularproteinfromalltheothersinthestartingmaterial,exploits利用:SolubilitySizeChargeHydrophobicityor/andspecificbindinga

3、ffinityoftheproteinofinterestProteinPurificationandCharacterization７.1蛋白质的酸碱性质Ionizationofprotein对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)。++++++++－－－－－－－－++++++++－－－－－－－－带正电荷蛋白质（亲水胶体）等点电时的蛋白质（亲水胶体）带负电荷蛋白质（亲水胶体）脱水脱水脱水带正电荷蛋白质（疏水

4、胶体）带负电荷蛋白质（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒（沉淀）蛋白质胶体颗粒沉淀碱酸碱碱酸酸沉淀技术Ionizationofprotein蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下可以发生明显的变化。蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点(isoionicpoint)。acidexcesspositivechargeCationexchangerisoelectricpointbalancedpositiv

5、eandnegativechargealkalineexcessnegativechargeAnionexchanger310pH_+OverallchargeonproteinTheoverallchargeonaproteindependsonpHIonizationofprotein7.2蛋白质分子的大小与形状Proteinsizeandshape7.2.1根据化学组成测定最低相对分子质量铁的原子量铁的百分含量=───────×100最低相对分子质量铁的原子量最低相对分子质量=───────×100铁的百分含

6、量55.8例如，肌红蛋白相对分子质量=───×1000.335=16700用其他物理化学法法测得的肌红蛋白Mr与此极为接近，可见肌红蛋白分子中只含一个铁原子。Proteinsizeandshape7.2.2渗透压法测定相对分子质量渗透与渗透压渗透压法测定相对分子质量溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向净移动现象称为渗透(osmosis)。渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高，直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压（osmoticpressure)。渗透压是单位

7、体积内溶质质点数的函数，而与溶质的性质和形状无关。在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的关系为：π=RT(c/Mr+Kc2)Mr=RT/limπ/cc→0渗透压法测定相对分子质量7.2.3蛋白质的扩散和扩散系数扩散（diffusion）dm/dt=-DAdc/dxD扩散系数，A扩散面积扩散系数随Mr的增加而降低。但扩散系数对Mr的变化并不敏感，一般不单独用来确定Mr。7.2.4沉降分析法测定相对分子质量蛋白质溶液在电场中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降的速率与蛋白质

8、分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。沉降速率法沉降平衡法沉降分析法测定相对分子质量离心机转速60000-80000rpm离心力40000-700000g沉降分析法测定相对分子质量离心力4π2v2rF=-----------------gF:离心力，单位以地心引力的倍数g表示（即g或×g）g:重力加速度，等于980.6cm2/s2.r:通