蛋白质的通性纯化和表征知识分享.ppt

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1、蛋白质的通性纯化和表征本章重点蛋白质分离基于蛋白质的哪些性质？主要纯化方法的原理？大概能够针对蛋白质的性质的差异设计相应的实验方案对蛋白质进行分离一　蛋白质的酸碱性质1.蛋白质分子的可解离基团2.等电点：在某一pH,蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，静电荷为零，这一pH称谓蛋白质的等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数目以及溶液的pH。每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等

2、电点的关系:等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。3.等离子点蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化。Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42-等离子点是蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的pH值。等离子点是一个特征常数。二蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质溶液中，蛋白质分子的直径介于1～100nm，该分散系统为胶体溶液系统。布郎运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。胶体系统保持稳定的三个因素颗粒大小在1～100nm范围内颗粒表面带有同种净电荷与水形成水化层（一）胶体性质由于

3、蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，与周围的反离子构成稳定的“双电层”，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。稳定亲水胶体的因素：水化膜表面电荷当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。应用:(1)蛋白质分离纯化(2)解毒(3)临床

4、检验（二）蛋白质的沉淀+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化层++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用蛋白质的聚沉蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图(1)盐析法(saltingout)向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。常用的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质沉淀的方法概念：特点：作用原理:盐离子与水亲和力极强，脱去蛋白水化层而聚集沉淀(2)有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介

5、电常数，使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。必须在低温下操作注意事项:尽量缩短处理的时间及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇、乙醇、丙酮缺点：原理:常用有机溶剂:常会使蛋白质变性重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。(3)重金属盐沉淀法此法常使蛋白质变性失活。若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生缺点：原理:生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀。(4)生物碱试剂和某些

6、酸类沉淀法反应溶液的pH

7、，不但需要把样品提纯到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要尽量避免因变性而失活；◆在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。1、总目标（1）增加制品的纯度（purity）或比活性（specificactivity）即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性；（2）并且使目标蛋白质的产量达到最高值。（二）一般原则2、分离提纯的一般程序含有目标蛋白质的动植物组织、细胞或微生物体前处理可溶性蛋白质混合物抽提液粗分级分离已除去大量杂质的蛋白质浓缩液细分级分离高纯度的蛋白质制品第一步：前处理破碎

8、含有目标蛋白质的动植物组