蛋白质的通性、纯化和表征讲课教案.ppt

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1、蛋白质的通性、纯化和表征Table1-4胃蛋白酶溶菌酶（二）蛋白质分子的大小与形状1.大小蛋白质是高分子量物质，不能透过半透膜。化学组成测定法沉降分析法渗透压法扩散法凝胶过滤法SDS-PAGE法(1)根据化学组成测定最低分子量：最低分子量=被测元素的原子量该元素的百分含量例：肌红蛋白含Fe0.335%，其分子量为？最低分子量=55.8/0.335%=16700（2）沉降分析法（教材p40）沉降系数（S）：单位离心场下的沉降速度，用S表示。1个沉降系数单位：1S=10-13秒(Svedbergun

2、it)生物大分子的沉降系数在1~200S之间。例：血红蛋白4.46S蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，沉降系数s大体和分子量成正比。故可用超离心法测定蛋白质分子量。Fig.1-82离心机结构示意图斯维得贝格方程计算蛋白质分子量：M=RST/D(1-vr)R:气体常数T:绝对温度D：扩散系数r：溶剂密度V:偏微比容2.形状溶液中蛋白质的形状可用摩擦比f/f0（不对称系数）描述。f/f0＝1.0分子近球形f/f01.0分子不对称，值越大，不对称程度越高f:实验测得的摩擦系数f0：蛋白质为非溶剂

3、化刚性球体时的摩擦系数（三）蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀1.蛋白质是亲水胶体（hydrophiliccolloid）2.蛋白质的沉淀（precipitation）破坏水化层与双电层的因素可破坏蛋白质胶体的稳定性而使其沉淀。水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。方法试剂原理应用盐析法(NH4)２SO4NaCl脱去水化层中和电荷分级盐析沉淀蛋白质有机溶剂沉淀法乙醇、丙酮等脱去水化层粗制备蛋白质重金属盐沉淀法Hg2+Pb2+Ag+Cu2+带负电荷蛋白质颗粒与重金属阳离子结合成不溶性盐例：牛奶解毒生

4、物碱试剂及某些酸沉淀法单宁酸苦味酸等带正电荷蛋白质颗粒与酸根负离子结合成不溶性盐例：临床除干扰蛋白加热变性沉淀法天然构象解体，疏水基外露，加少量盐可促进此过程例：制豆腐(盐卤MgCl2)（四）蛋白质的颜色反应反应名称试剂颜色反应有关基团应用双缩脲反应碱性铜试剂紫色2个肽键蛋白质定性、定量茚三酮反应茚三酮紫色游离-氨基游离-羧基aa及蛋白质定性定量Folin-酚试剂反应碱性CuSO4磷钼酸磷钨酸蓝色2个肽键酚基蛋白质定量黄色反应浓HNO3NaOH黄色苯环含苯环aa及蛋白质定性乙醛酸反应乙醛

5、酸浓硫酸紫红色吲哚基Trp及蛋白质定性米伦反应亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液红色↓酚基Tyr及蛋白质定性二、蛋白质的分离提纯细分级前处理粗分级盐析等电点沉淀有机溶剂分级沉淀层析电泳凝胶过滤离子交换层析亲和层析一般原则选材脱盐、浓缩、干燥和保存生物原料：植物、动物器官与组织、微生物。选择生物原料的原则：富含所要纯化的蛋白质、容易获取与处理选材：机械方法：研磨法、组织捣碎法、匀浆器破碎法物理方法：反复冻融法、超声破碎法、渗透压法化学与生化方法：溶剂处理法、表面活性剂处理法、酶解法前处理分离可溶蛋白质

6、和不溶的杂质。粗分级大都是非层析法，例如盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法等等。除去杂蛋白：热变性、酸碱变性、在常温下使用有机溶剂（不可逆沉淀）；分离目标蛋白：盐析、等电点沉淀、在低温下使用有机溶剂（可逆沉淀）。分离纯化方法根据分子大小不同的分离方法利用溶解度差别的分离方法根据电荷不同的分离方法根据吸附力不同的分离方法根据对配基的特异生物学亲和力的分离方法透析和超过滤密度梯度（区带）离心凝胶过滤（一）根据分子大小不同的分离方法蛋白质大分子半透膜小分子小分子透析和超滤超滤法：利用一种

7、特制的薄膜（超滤膜）对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。当溶液在一定压力下（外源氮气压、真空泵压或因离心产生的压力）通过膜时，分子量小的小分子可透过膜，大分子被截留于原来溶液中。作用：脱盐、浓缩、更换缓冲液、分离生物大分子。透析和超滤凝胶过滤（gelfiltrationchromatography）(分子排阻层析Sizeexclusionchromatography,分子筛层析)凝胶过滤的介质凝胶类型：交联葡聚糖凝胶（Sephadex）聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）琼脂糖凝胶(Seph

8、arose)复合凝胶(Superdex)凝胶珠（凝胶颗粒），内部为多孔网状结构。凝胶的交联度决定分级分离范围。Fig.1-83Gelfiltration.Thismethodseparatesproteinsaccordingtosize.凝胶过滤的原理层析洗脱时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠网状结构，而最先流出柱外；比凝胶网孔小的分子可进入凝胶珠网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外。这样可使大小不同的分子得以分离。测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve。以相对分子量的对数logM对Ve作图，得标