第3章 蛋白质的通性、纯化和表征

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1、第3章蛋白质的通性、纯化和表征一、 蛋白质的酸碱性质和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。等电点：对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质在电场中不移动,溶解度最小，粘度最大。可以用溶解度法、聚焦电泳法等测定等电点。二、 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性。1、 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：①蛋白质表面的亲水基团形成的水化层将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀；②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚

2、集沉淀。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。一旦电荷被中和或水化层被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。2、  沉淀蛋白质的方法①盐析法:大量的中性盐（（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀；不引起变性。②有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等；③重金属盐沉淀法：pH＞pI时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）结成不溶性沉淀；④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于pI时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、

3、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸；⑤加热变性沉淀法。三、蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质：增加制品的纯度或比活力一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶。电泳前处理粗分离细分离生物组织无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析1、前处理（pretreatment）：①将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理；植物组织和细胞：石英砂+提取液研磨或用纤维素酶处理；细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）②如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组分；

4、③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。2、粗分级分离（roughfractionation)一般用选择性沉淀法。①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点沉淀法③有机溶剂分级沉淀法3、细分级分离（finefractionation)★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC）★电泳法：凝胶电泳、等电聚焦、双向电泳等4、结晶（晶体保存）结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶

5、剂、调节pH。四、 蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小的差异透析法：将样品装在透析袋里，半透膜阻留pr分子，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。①透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透膜的性质除去样品中的小分子非蛋白物质。超过滤法：施以一定的压力强迫小分子物质通过半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。②凝胶过滤法（分子筛层析法）凝胶过滤常用的介质：在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。交联葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖与环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物）。聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶凝胶过滤的原理（二）根据溶解度差异的分离法蛋白质的盐溶与盐析盐

6、溶：是指在适当的中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，称盐溶。盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的分级沉淀法分离各种蛋白质。（三）根据电荷性质的差异1、电泳法电泳：带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象称为电泳。分子量小的蛋白质泳动快，分子量大的泳动慢，于是蛋白质被分离。2.SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物

7、，根据被分离物质所带电荷的多少、分子形状、分子大小的不同，在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的方法。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成。网状的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。SDS(sodiumdodecylsulfate)若在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，SDS是一种阴离子表面活性剂，几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质