凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾1.ppt

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1、凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾返回目录掌握凝胶层析技术的原理及分子筛分离不同组分原理熟悉凝胶过滤法的操作步骤实验目的凝胶过滤层析：是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也称分子筛层析。实验原理实验原理凝胶过滤法为层析技术，层析技术是利用待分析物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分的不同程度分布在两相中（磷酸缓冲液pH=7.0流体相，葡聚糖凝胶固体相）葡聚糖凝胶是在右旋葡萄糖的线性聚合物长链间与交联剂1-氯代-2,3环氧丙烷通过醚桥交联而成，吸水后具三维网状结构。分子筛效应

2、：高铁血红蛋白的大分子不能进入葡聚糖孔径，只能在晶体与晶体的间隙中随缓冲液流动相下移，速度较快，高铁氰化钾为小分子物质，在葡聚糖三维结构中，速度较慢。Hb﹢K3Fe(CN)6MetHb﹢K3Fe(CN)6过量少量层析MetHbK3Fe(CN)6收集比色实验原理Hb（Mr=64500）加入过量的高铁氰化钾（K3Fe(CN)6，Mr=329.25）可形成高铁血红蛋白（MetHb）为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，利用分子筛分离的分子大小不同的原理，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶粒，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的

3、不同，可直接观察到MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，达到完全分离的目的。高铁血红蛋白的大分子在葡聚糖晶体与晶体的间隙中随缓冲液流动相下移，速度较快，高铁氰化钾为小分子物质，在葡聚糖三维结构中，速度较慢，所以先收集到的是高铁血红蛋白，然后是高铁氰化钾。单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。交联葡聚糖的凝胶颗粒交联葡聚糖高铁血红蛋白与高铁氰化钾混合物高铁血红蛋白高铁氰化钾高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色，Mw=64500)，完全排阻高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)

4、6，黄色，Mw=327.25)，可完全进入凝胶颗粒网孔内，从而达到分离的目的实验试剂血红蛋白溶液交联葡聚糖G-250.4%K3Fe(CN)60.1mol/L磷酸缓冲液（pH=7.0）实验仪器玻璃层析柱分光光度计刻度试管葡聚糖凝胶的准备G-25颗粒(5g)蒸馏水室温溶胀去除杂质10倍体积的磷酸缓冲液浸泡(过夜)实验步骤实验步骤层析柱的准备：把洗干净的层析柱垂直夹于蝴蝶夹上，用刻度尺在15cm处和8cm处划线。装柱从层析柱顶部用小烧杯倒入少量缓冲液，将气泡赶出，然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高。将平衡后的交联葡聚糖G-

5、25悬浮液边搅拌边加入柱内，使液体流出，继续不断的加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高15cm左右为止。用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，准备上样。装柱加入缓冲液排出管中气泡将凝胶缓缓注入管内自然沉降至柱床高度达15cm层析管洗净、固定在铁架上装柱要求:连续均匀无气泡无分层样品：Hb液1滴+K3Fe(CN)610滴+DDW2滴混合上样、洗脱：使柱内溶液流出至刚露出柱床面时，吸样品0.5ml，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿摇动床面。使样品进入床内，直至床面重新露出，沿管壁加入少量缓冲液，等

6、再次露出床面后再沿管壁加入缓冲液至柱顶，整个洗脱过程保持缓冲液在柱顶的位置。带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图收集：以每管1ml进行收集，并且观察柱上的色带，待黄色的K3Fe(CN)6色带完全脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液，结束收集。测定:将每管收集液加入缓冲液至4ml，混匀，以最后一管为空白管，在425nm处测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡或分层时需重新装柱，柱床面平整；洗脱时流速不可太快，

7、否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。注意事项MetHb的相对分子量较大，直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较短，移动速度快，首先流出。实验讨论与分析K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中流程较长，移动速度慢，最后流出。向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或太慢？思考题