08 生物化学实验--凝胶过滤法分离高铁血红蛋白和铁氰化钾

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1、凝胶过滤法分离高铁血红蛋白和铁氰化钾【目的】1．掌握凝胶过滤法的原理和操作过程。2．熟悉透析法在蛋白质分离纯化中的作用。【原理】血红蛋白加入过量的铁氰化钾形成高铁血红蛋白（MetHb）。本实验应用凝胶过滤法去掉多余的铁氰化钾，用透析法除去高铁血红蛋白中的磷酸盐。1．凝胶过滤除去铁氰化钾凝胶过滤的原理主要是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应不同而进行分离（见第2篇第2章）。将MetHb和铁氰化钾的混合物通过交联葡聚糖G-25的凝胶过滤柱，用pH7.0的缓冲液冲洗，使它们相互分离。从颜色的不同可直

2、接观察到MetHb（红褐色）洗脱较快，小分子铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，然后分别收集。2．用透析法除去磷酸盐透析是利用半透膜只允许小分子通过，不允许较大分子通过来分离物质的方法。将凝胶过滤收集后的MetHb溶液装入透析袋内。MetHb溶液中含有磷酸盐，经过透析使其脱盐。用钼酸铵和氨基奈酚磺酸试剂进行定磷测定，用15%三氯醋酸的沉淀反应鉴定蛋白质。【器材】1．1.5×25cm层析柱2．离心机3．分光光度计4．透析袋（长10cm）5．橡皮筋6．锥形瓶7．滴管【试剂】1．抗凝全血2．CCl43．生理盐水

3、4．交联葡聚糖G-255．0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）6．0.4%K3Fe(CN)67．氨基奈酚磺酸试剂8．钼酸铵试剂9．15%的三氯醋酸【操作】1．凝胶准备称取交联葡聚糖G-25型5g，倾入锥形瓶中，加60ml左右蒸馏水溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去表面的细粒，如此三次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜以达平衡。2．装柱取层析柱一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，把柱底烧结玻璃上下方的气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液6cm高，将平衡后的交联葡聚糖

4、G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断加入悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止，床面上约盖3ml的缓冲液，关闭出口。稳定5-10min后，打开出口，用两倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。装柱后检查柱床是否均匀。若有气泡或分层的界面时需要重新装柱。3．样品的处理（1）溶血液的制备：取3ml草酸盐抗凝全血离心，吸去上层血浆，向红细胞层加入5倍体积的冰冷生理盐水，混匀后离心（3500r/min）5min，弃去上层清液，如此洗三次。最后一次吸去上清液后，在

5、红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇，继续加1/2体积CCl4，用力摇3min，离心（3500r/min）5min，吸取上层澄清的溶血液备用。此法制得的Hb溶液浓度为10%（置4℃备用，一周用完）。（2）样品：3滴溶血剂加8滴铁氰化钾混合，制成MetHb混合液样品。4．上样、洗脱打开平衡好的层析柱口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。用滴管吸取约0.5ml混合物样品，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿扰动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同时加入1～2倍样品

6、量体积的洗脱液（这样可以使样品稀释至最小，而样品又完全进入床内），当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液进行洗脱（但注意切勿扰动床面凝胶）。5．收集、观察、测定用自动部分收集器以每分钟5滴、5分钟一管的速度进行收集，并且观察柱上的色带。当棕色的MetHb洗脱下来后，收集各管作透析。待黄色的铁氰化钾色带完全洗脱下来，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口将每管收集液加入缓冲液至4ml混匀，在425nm处测其吸光度值，以管数为横坐标，吸光度值作纵坐标，画出洗脱图谱。6．透析把透析袋、橡皮筋

7、放在盛有蒸馏水的烧杯内浸湿，用橡皮筋扎紧透析袋的一端，然后用滴管吸取MetHb洗脱液装入袋内（注意勿使洗脱液流到袋的外面），约装入4ml左右，扎紧袋的另一端。取小烧杯一个加50ml蒸馏水，按下列两表分别取出杯内蒸馏水，各自加入干净试管，留作对照。然后将装好样品的透析袋悬入杯内蒸馏水中，并用玻璃棒不断搅拌，透析一个小时。7．鉴定（1）磷酸盐的鉴定：取试管2支，编号，按下表操作试剂试管透析前杯内蒸馏水透析后杯内蒸馏水钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果试管110滴—2滴3滴试管2—10滴2滴3滴观察记

8、录结果并解释之。（2）蛋白质的鉴定：取试管3支，编号，按下表操作试剂试管透析前杯内蒸馏水透析后杯内蒸馏水透析袋内溶液15%三氯醋酸反应结果试管1试管2试管310滴———10滴———10滴5滴5滴5滴观察记录结果并解释之。【注意事项】1．胶床内不得有气泡、断层。胶床表面应平整。如出现上述情况，应重新装柱。2．加样时要用滴管将样品沿管壁缓慢加入，勿将胶冲起或破坏胶面平整，否则会造成样品扩散，影响分离效果。3．透析袋口要扎紧，以防袋内容物露出。【思考题】1．凝胶过滤的原理是什么？操作应注意什么？2．什