凝胶过滤法分离纯化大豆蛋白肽

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1、第22卷第1期齐齐哈尔大学学报Vo1.22,No.12006年1月JournalofQiqiharUniversityJan.,2006凝胶过滤法分离纯化大豆蛋白肤邹存媛郑永杰卢鹤(齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，齐齐哈尔大学161006)摘要:本文采用中性蛋白酶AS1.398水解大豆蛋白，通过正交实验确定最佳水解条件:水解温度、pH值分别为48℃和7.5，底物浓度为5%(W/V)，酶用量为6%,酶解时间为4h，此时水解度(DH)达到24.57%。并对水解产物进行脱苦脱色，然后采用超滤以及凝胶过滤色谱法分离分子量1200以下的小肤并收集。关键词:大豆肤;酶水解;超滤;凝

2、胶过滤中图分类号:0658.1文献标识码:A文章编号:1007-984X(2005)04-0027-04本文研究的大豆肤是指大豆蛋白质经过水解、分离、精制等过程而获得的通常由3一6个氨基酸组成的、相对分子质量低于1000的低肤混合物f}l0肤类的相对分子质量主要分布在300一700范围内121，其中还含有少量的游离氨基酸、糖类、无机盐等成分。过去的研究认为，蛋白质在体内是经体内蛋白酶水解成氨基酸形式被吸收的。最近的研究表明，蛋白质在体内消化后并不完全以氨基酸形式被吸收，也可是以寡肤(尤其是二肤、三肤)形式被吸收。据资料报道，小分子大豆肤不仅具有很好的溶解性、低粘度、抗凝

3、胶形成性，而且在体内消化吸收快，蛋白质利用效率高;大豆肤具有低抗原性，不会产生过敏反应，能增强运动员体能和肌肉，促进肌红细胞复原，帮助恢复疲劳;能促进脂肪代谢，消除过多脂肪;还能促进发酵作用，产生有益分泌物;另外，大豆肤具有生理活性(抗氧化性)等。为此，可将大豆肤应用于酸性饮料和保健饮料，也可应用于病员食品、运动员饮料、婴幼儿食品或特殊人群食品(如减肥食品)等1310本实验选择一种对功能性好的肤段具有良好选择性的酶对大豆蛋白进行水解，并对水解产物进行分离，获得小肤，为制得小肤产品提供依据。1材料与方法1.1材料大豆分离蛋白;AS1.398中性蛋白酶，购于无锡酶制剂厂;葡

4、聚糖凝胶G15，购于上海亚东核级树脂有限公司;NaOH(分析纯);HCL(分析纯);磷酸二氢钠(分析纯);磷酸氢二钠(分析纯)1.2主要实验仪器HZS-H水浴振荡器;PHS-25型酸度计;80-2型离心沉淀机;BSI10S型电子天平;超滤装置;BSI-100自动部分收集器;722一光栅分光光度计;1000pL微量进样器1.3测定方法水解度计算(DH):(pH-Stat法)伙蛋白含量测定采用folin-酚法1.4酶水解实验，1.4.1正交实验因素的选择影响酶水解速度的因素很多，如反应温度、pH值、底物浓度、酶用量等。给定的酶水解温度和pH值是一定的，根据单因素实验确定酶的

5、最适水解温度48℃和pH值为7.5.收稿日期:2005-06-29作者简介:邹存媛，女，硕士研究生，主要从事分析化学与生物化学的研究工作。·28·齐齐哈尔大学学报2006年确定以上两个因素后，以底物浓度、酶用量、水解时间进行三因素三水平的正交实验。1.4.2酶水解反应按一定底物浓度(WN)称取大豆分离蛋白，加人一定量的蒸馏水，搅拌，于90℃水浴下预处理15min,冷却至48℃后调pH值至7.5，加人一定量的酶(W/W)(相对于大豆蛋白)，将其放人到水解反应装置中进行酶水解。水解过程中不断加入O.lmoIAL的NaOH溶液，使pH值稳定在7.510.1的范围内，开始每10

6、min记录消耗的碱液量，半小时后每隔30min记录耗碱量。反应到预定时间后即停止加热搅拌，在9090灭酶10min，用0.1mol/LHCL调节pH值为4.3(大豆分离蛋白等电点)，冷却后用4000r/min的离心机离心分离。1.4.3超滤分离将水解产物1000mL分别通过三种超滤膜进行分离，分别获得分子量在>>20000,20000一10000,10000-6000,<60004个肤段。1.4.4脱苦脱色处理对6000以下肤利用活性炭151进行脱苦脱色处理，脱苦脱色条件为:活性炭0.03%(WN)，53-C,pH值4.3一4.5，慢速搅拌2h，抽滤得大豆肤样品。1.4

7、.5凝胶过滤分离将6000以下的肤通过SepHadexG15进行分离收集分子量1200以下的肤段。2结果与讨论2.1AS1.398中性蛋白酶参数的确定表1正交实验因素水平表(哪')水平底物浓度(WN,%)加酶量(%)酶解时间(h)表2正交实验方案及实验结果分析实验号BC空白指标234水解度(%)5823.5:15.455904.0305452.5.55.555505.245︸5478.5.85.675，今5.124‘山l671.1I71.811内18.701jl487.1’81.851lj几8.148Jy=T心l196.:14I819.5