1(1).实验一.ppt

《1(1).实验一.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、分子生物学其它常用实验仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器实验一聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段实验目的实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤实验结果与讨论实验目的掌握PCR反应的原理及技术实验原理聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术；利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝；PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于

2、DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。PCR：变性－退火－延伸PCR(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的扩增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5’3’3’5’引物1互补链引物2互补链目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)反应分为三步：变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条

3、件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到106-107个拷贝。PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.PCR仪2.台式离心机3.微量取液器4.紫外荧光观测仪5.高压灭菌的微量离心管6.DNA扩增系统7.琼脂糖凝胶电泳系统（二）材料模板DNA:800bp的片段插入在pEASY-T1载体（或pMD18-T或KS载

4、体)（三）试剂1.10×PCRbuffer2.dNTPs：2.5mM×43.Taq酶：5U/µL4.引物1和2(M13F,M13R)：2μmol/LpMD18-TVector四、实验步骤1.在0.2mlEppendorf管内配制25μl反应体系：ddH2O：18.25µl(25-6.75)×710×PCRbuffer：2.5µl×7dNTPs（2.5mM×4）2µl×7M13-F(10µM)：0.5µl×7M13-R(10µM)：0.5µl×7Taq酶：0.25ul×7模板：1µl/每管注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水2.按下述循环程序进

5、行扩增94℃5（3）分钟，1个循环；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分25秒；30个循环；72℃延伸10分钟。4℃保温。3.扩增结束后，取全部PCR扩增产物进行1%的琼脂糖电泳，检测扩增情况、分析结果。并在紫外灯下切割扩增的琼脂糖胶块中的DNA片段、放入Eppendorf管中。4℃冰箱存放，用于回收。五、实验结果与讨论PCR体系的调制过程中应尽量减少污染的机会，以免出现目的条带以外的杂带。如退火温度过低，也可能出现杂带。12345678910111213M使用3mg的DNAMarkerDL2,000（500ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳

6、后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。注意事项PCR反应是在一个在没有DNA污染的干净环境中进行。一般而言，只要能够得到可靠的结果，模板纯化的方法越简单越好。要使用新配制的或适当贮存的未使用过的试剂或缓冲液来提取核酸，不要使用以前用于别的样品的试剂。所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。配制试剂，操作样品，建立反应和以后的检测扩增产物过程中最好都使用手套。所有PCR试剂中使用的水都应该用新鲜蒸馏的去离子水，高压灭菌后分装备用。所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成小份

7、以确保实验间的连续性。所有试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和离心管，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。PCR样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。扩增反应应当设计不加模板的阴性对照，电泳时应当加标准DNA分子量标记（Marker）以估计产物的大小。琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在紫外光下DNA发出的荧光是可见光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，因而DNA的检测很方便。如将已知大小和浓度的标准样品（Ma

8、rker）作电泳对照，就可估计出待测样品的大小和浓度。1.琼脂糖2.TAE电泳缓冲液(50×):Tris242g,冰醋酸57.1ml,0