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1、实验五酶促反应动力学实验(Experimentsonenzymekinectics)遵义医学院生物化学教研室朱欣婷生化教研室朱欣婷1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响。2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响。3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的km值。生化教研室朱欣婷酶促反应动力学:影响酶促反应速度(V)的因素:研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。1.底物浓度[S]2.酶的浓度3.温度4.pH5.酶的激活剂6.酶的抑制剂生化教研室朱欣婷（一）底物浓度对酶促反应速度的影响当底物浓度较低时,V随[S]的增大而急剧上升,两者成正比关系.随着底物浓度继续增加,反应速度增加,
2、而幅度不断下降,若继续加大[S]反应速度就不再增加,达到一个极限值Vmax.Vmax[S](V)生化教研室朱欣婷[S]与V的关系:米-曼氏方程Vmax--最大反应速度Km--米氏常数当V＝1/2Vmax时，Km＝［S］Km值的物理意义:即Km值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。生化教研室朱欣婷Km和Vmax值的测定(1)测定不同底物浓度的反应初速率，以V-[S]作图可以得到Vmax，再从1/2Vmax，可求得相应的[S]，即Km值。Vmax½Vmax[S]vKm生化教研室朱欣婷(2)双倒数作图法：将米氏方程式两侧取双倒数，以1/V-1/[S]作图，得出一直线.Km
3、和Vmax值的测定生化教研室朱欣婷（二）抑制剂对酶促反应速度的影响酶的抑制剂：抑制作用类型可逆性不可逆性竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性，但不使底物变性的物质。生化教研室朱欣婷1.竞争性抑制曲线图竞争性抑制剂与酶的底物结构相似,与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶与底物的结合.特点:（1）V下降，发生抑制（2）Vmax不变（3）Km增大，亲和力下降生化教研室朱欣婷2.非竞争性抑制曲线图抑制剂与酶活性中心以外的必需基团结合,不影响酶与底物的结合,底物与抑制剂之间没有竞争关系.特点:（1）V下降，发生抑制（2）Vmax减小（3）Km不变生化教研
4、室朱欣婷3.反竞争性抑制曲线图特点:(1)V下降，发生抑制(2)Vmax减小(3)Km减小生化教研室朱欣婷（三）本次实验方案碱性磷酸苯二钠本次实验以为底物,为催化剂,作为抑制剂，分别观察无抑制剂和有抑制剂时底物浓度与酶促反应速度之间的关系。磷酸酶AKP磷酸氢二钠生化教研室朱欣婷C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=OH3C-NOH+C6H5NH3C-NH3C-CC-N=C=OH3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二钠+H2OAKPOHHO-P=OONaONa+酚醌衍生物为红色,根据红色深浅测出光密度值,计算不同底物浓度时酶
5、的反应速度（以产物的生成量表示）,以1/V-1/[S]双倒数作图，获得Km值。生化教研室朱欣婷添加试剂（两人一组，1人按照p45，另1人按照p50的要求量取溶液）37摄氏度水浴准确保温15分钟立即加入碱性溶液1.10ml终止反应0.3%4-氨基安替比林1.00ml0.5%铁氰化钾2.00ml每步充分混匀,室温放置10分钟以0管调零,波长510nm比色生化教研室朱欣婷[计算公式]1.计算出无抑制剂和有抑制剂时各管中底物浓度S.2.计算出无抑制剂和有抑制剂时各管的反应速度V.反应速度用产物的生成量来表示:每ml酶液在37℃反应15分钟产生酚的量[S]=C基质液×V基质液/V总产物生
6、成量=A测/A标×C标酚×V标酚×1ml/0.1ml生化教研室朱欣婷12345678标AAi表1.不同底物浓度时溶液的光密度值12345678标[S](mol/L)1/[S](mol/L)-1V(mg/15min)1/V(mg/15min)-1Vi(mg/15min)1/Vi(mg/15min)-1[计算结果]表2.底物浓度及反应速度生化教研室朱欣婷[作图]1/[S]1/V-1/Km根据图获得Km,并判断磷酸氢二钠为何种抑制剂.时间:仪器型号:仪器编号:作图者:1/Vmax生化教研室朱欣婷1.两人一组，一人做无抑制剂的，另一人做有抑制剂的实验。2.取样量准确,保温准确，加样顺序
7、要一致，每步均混匀。3.同一组实验用相同的比色计。4.作图时,实验点不在同一条直线上时,尽量使各点平均分布在直线的两侧,两图画在同一坐标纸上,便于判断。生化教研室朱欣婷1.米氏常数（Km）有无单位？为什么？2.本实验中能否不用计算反应速度，直接以各管测得的光密度代表各管中酶的反应速度行不行？为什么？3.如果不用本实验原理中所列的几种变换公式，是否还可以从实验结果求出Km值?如有应如何求？思考生化教研室朱欣婷[下次实验预习]1.核酸的分类，以及在细胞中的分布情况。2.核酸的组成。3.离心技术的
