酶促反应动力学实验

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1、酶动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。2、米氏方程：Michaelis-Menten在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：(1)式中：v表示酶促反应速度，表示酶促反

2、应最大速度，[S]表示底物浓度，表示米氏常数。3、值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1，a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。②Lineweaver-Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便

3、、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver-Burk方程式：(2)以对作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—。③Hofstee作图法（略）把（2）式等号两边乘以，得：(3)以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。④Hanas作图法（略）把（2）式等号两边乘以[S],得：(4)以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为。（a）(b)本实验主要以双倒数法，即Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：本实验以碱性磷

4、酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴2.721型分光光度计试剂：1．酚试剂：称钨酸钠（W·2O）100g，钼酸钠（Mo·2O

5、）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。2．2.5mM磷酸苯二钠

6、基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2•2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。3．碱性缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.4．碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。【实验步骤】取6支试管按下表加入试剂：1234562.5mM磷酸苯二钠（ml）0.20.40.60.81.01.0蒸馏水（ml）0.80.60.40.2-0.1碱性缓冲液

7、（ml）1.01.01.01.01.01.0混匀后，60℃欲温5分钟0.10.10.10.10.1-碱性磷酸酶液（ml）混匀后，60℃水浴13分钟（准确计时）注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加2）此时为酶促反应，总体积2.1ml3）第六管不加酶。酚试剂（ml）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(ml)3.03.03.03.03.03.0混匀后，室温放置15分钟注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试剂后酶促反应即停止。2）Na2CO3提供碱性环境，加入Na2CO3后试剂

8、才显色以6管为调零点，在620nm波长处比色。【结果处理】1将各管光密度和底物浓度记入下表管号O.D1/O.D[S]1/[S]123452以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver-Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km值。【注意事项】1）加入碱性磷酸酶的量要准确2）保温时间要准确准确保温的方法：从第一管加入酶液