酶促反应动力学实验

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1、专业资料分享酶动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。2、米氏方程：Michaelis-Menten在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：(1)式中：v表示酶促反应速度，表示酶促反应最大速度，[S]表示底

2、物浓度，表示米氏常数。3、值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1，a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而1/2不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。②Lineweaver-Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Linewea

3、ver-Burk方程式：(2)完美DOC格式整理专业资料分享以对作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—。③Hofstee作图法（略）把（2）式等号两边乘以，得：(3)以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。④Hanas作图法（略）把（2）式等号两边乘以[S],得：(4)以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为。（a）(b)本实验主要以双倒数法，即Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚

4、和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：完美DOC格式整理专业资料分享然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴2.721型分光光度计试剂：1．酚试剂：称钨酸钠（W·2O）100g，钼酸钠（Mo·2O）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50

5、mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。2．2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2•2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释

6、至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。3．碱性缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.4．碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。【实验步骤】取6支试管按下表加入试剂：1234562.5mM磷酸苯二钠（ml）0.20.40.60.81.01.0蒸馏水（ml）0.80.60.40.2-0.1碱性缓冲液（ml）1.01.01.01.01.01.0混匀后，60℃欲温5分钟0.10.10.10.10.1-完美DOC格式整理专业资料分享碱性磷酸酶液（

7、ml）混匀后，60℃水浴13分钟（准确计时）注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加2）此时为酶促反应，总体积2.1ml3）第六管不加酶。酚试剂（ml）1.01.01.01.01.01.010%Na2CO3(ml)3.03.03.03.03.03.0混匀后，室温放置15分钟注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试剂后酶促反应即停止。2）Na2CO3提供碱性环境，加入Na2CO3后试剂才显色以6管为调零点，在620nm波长处比色。【结果处理】1将各管光密度和底物浓度记入下表管号O.D1/O.D[S]1/[S]123452以1/O.D

8、为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lineweaver-Burk作图，求出碱性磷酸