人源化抗体与单克隆抗体制备的主要方法.ppt

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1、抗体的生物学活性1）特异性结合抗原2）激活补体3）结合Fc受体4）穿过胎盘5）免疫调节SCIDTherecombination–activatinggenes(RAG-1/2)requiredforsynthesisofthefunctionalIgandTCRthatcharacterizematureBandTcells.多克隆抗体用抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清），是由体内分别针对抗原物质上的多个抗原表位(frommultipleplasmacells)，分别诱导多个不同B细胞克隆发生应答后产生的多种抗体，因此叫多克隆抗体。通常是指由一株B淋巴细胞杂交瘤增殖扩增而成

2、的单一细胞克隆所产生的一种高度均一、高度专一性的抗体。单克隆抗体Monoclonalantibody1975withatechniquedevisedbyKöhlerandMilstein(forwhichtheywereawardedaNobelPrize).Theydidthisbyliterallyfusingmyelomacellswithantibody-secretingcellsfromanimmunizedmouse.Thetechniqueiscalledsomaticcellhybridization.Theresultisahybridoma(NS-1).

3、NS-1是穩定的小白鼠BALB/c癌細胞株，除了能在培養基中永續生長外尚有一重要特性，細胞缺乏兩種核酸代謝重要酵素TK,thymidinekinaseHGPRT,hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferasepurinesHATmediumbecauseitcontains:•hypoxanthine•aminopterin•thepyrimidinethymidineThelogic:•UnfusedmyelomacellscannotgrowbecausetheylackHGPRT.•Unfusednormalspleencell

4、scannotgrowindefinitelybecauseoftheirlimitedlifespan.•HybridomacellsareabletogrowindefinitelybecausethespleencellpartnersuppliesHGPRTandthemyelomapartnerisimmortal.BcellmyelomafusionHATELISAELISA抗體生產：1)可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL左右；腹水中的抗體濃度非常高，每mL可達數mg。2)把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養

5、液上清即得抗體，但每mL只得約數mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。3)得到穩定的抗體後，通常要再以ELISA方法檢定該抗體的subclass是屬於IgG,IgM或IgA等。免疫時間太短的，較可能取得IgM，但一般仍以IgG較多，注意IgG又可分成幾種sub-subclass。4)所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰•硫酸銨分劃：收集約40%飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。•離子交換法：用DEAE陰離子交換法，多用在純化

6、IgG。•膠體過濾法：以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化IgM。•親和層析法：以ProteinA-吸著劑專一性地吸住抗體分子(IgG)。Toachievethisend,weraisedmonoclonalantibodiesagainsttheKcsAK+channelenlargecultureandselectedclonesonthebasisoftheirabilitytorecognizethetetramericbutnotthemonomericformofthechannel.抗体的检测1.ELISA用于检测针对可溶性抗原(蛋白质)和细胞表面抗原的mAb

7、。2.FACS(流式细胞仪)用于检测细胞表面抗原的mAb。3.用westernblot检测单抗的特异性。杂交瘤细胞的克隆化克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞