PCR-实验原理.ppt

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1、实验原理聚合酶链反应（PCR）PCR技术的基本原理利用DNA聚合酶，依赖DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间引发的聚合酶链反应。PCR反应的基本成分模板DNA（待扩增DNA）引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液PCR引物引物是人工合成的短DNA片断。它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。作用：引物决定了需要扩增的起始和终止位置。PCR反应的基本成分模板DNA

2、（待扩增DNA）引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液脱氧单核苷酸（dNTP）作用：用于构造新的互补链PCR反应的基本成分模板DNA（待扩增DNA）引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液DNA聚合酶—TaqDNA聚合酶特性：（1）具有95℃以上的耐热性（2）Mg2+依赖性酶作用：催化转录PCR反应的基本成分模板DNA（待扩增DNA）引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液适宜的缓冲溶液成分：50mmol/LKCl、10mmol/LTRIS-Cl、1.5mmol/LMgCl2、100μ

3、g/ml明胶、0.25μmol/L的引物、200μmol/LdNTP、25U的Taq酶和DNA样品作用：提供适合聚合酶行使功能的化学环境基本成分模板DNA（待扩增DNA）引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶适宜的缓冲溶液作用含有需要扩增的DNA片断决定了需要扩增的起始和终止位置用于构造新的互补链。复制需要扩增的区域。提供适合聚合酶行使功能的化学环境小结PCR的反应条件反应条件：温度、时间和循环次数温度：双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～7

4、5℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多PCR的反应动力学Y=(1+X)nY——DNA片段扩增后的拷贝数X——平均每次的扩增率n——循环次数体外PCR扩增和体内DNA复制PCR单链多态性分析单链构像多态性(SSCP)：是指单链DNA在溶液中形成立体构象，等长的DNA片段因其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同，形成的构像不同，在非变性

5、PAGE时表现为电泳速度的差别。PCR-SSCP:在完成靶DNA的PCR扩增之后进行的单链DNA多态性分析的一种新方法。检测方法：中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳