实验技术原理.ppt

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1、SNPs的检测方法2007.4.121SNPs的定义定义:单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。(99.9%)2SNPs的研究意义1.SNPs作为第三代遗传标记(已知性、可遗传性、可检测性),用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。___路标的作用传统研究策略(表征、蛋白、基因)逆向遗传学(表型、基因、蛋白),32.基因多态性研究研究SNPs本身对机体的影响(生理特征、病理条件下的千差万别)4SNPs

2、研究进展和方向1.SNPs数据库的构建发现2.SNPs功能的研究(在1的基础上)5SNPs检测方法1.理想的检测SNPs的方法——发现未知的SNPs,或检测已知的SNPs(1)灵敏度和准确度的要求(反应原理严紧)(2)快速、简便、高通量(操作和分析的自动化程度高)(3)费用相对低廉62.现状:到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。73.每种SNPs的检测方法都可将之看成由区分SNPs特异位点的原理方法和数据的检测分析手段两部分组成。8SNPs检测方法的分类一、区

3、分SNPs位点的方法1.基于杂交的方法2.基于酶的方法3.以构象为基础的方法4.直接测序的方法二、检测分析技术1.凝胶分析技术2.荧光检测技术3.DNA芯片4.质谱检测技术91.基于杂交的方法原理:短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时,完全匹配和有错配两种情况下,根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs位点检测出来。(差异越大,检测的特异性就越好)101)利用△Tm固定温度等位基因特异核苷酸探针(Allele-specificoligonucleotide,ASO)。修饰过的探针:引入一个错配的碱基、

4、PNA、LNAs等动态的加热过程——动态等位基因特异杂交(dynamicallele-specifichybridization,DASH)11核酸肽探针 (Peptidenucleicacids,PNA)其骨架是肽键特点:1、与靶分子高特异性地结合(3个方面的影响)2、链挤入(形成三链复合结构)(表达调控以及反义治疗方面)3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感(体外应用)121、与靶分子高特异性地结合Tm值高受盐浓度影响小(低盐浓度的体系)△Tm更大(一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度)所以,PNA/

5、DNA的非特异结合能得到很好的排除。13LNA(lockednucleicacids)其结构是在RNA分子的2′羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。特点:1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA或LNA结合(构象更利于杂交的稳定)2.匹配和不匹配的△Tm增加14DASH(dynamicallele-specifichybridization)152)杂交+荧光共振分子信标(双分子间杂交)蝎状探针(分子内杂交)16分子信标(Molecularbeacons)17蝎状探针(Scorpionpr

6、imer)182.基于酶的方法1)DNA聚合酶2)连接酶3)限制性内切酶4)外切酶FEN5)RNaseH191)DNA聚合酶等位基因特异性PCR多重等位基因特异性PCRTaqman法引物延伸法焦磷酸测序法20等位基因特异性PCR21Taqman法22微测序法/引物延伸法23基本步骤(液相)1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA2.对PCR产物进行纯化(去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸产物检测(放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等)24APE

7、X(arrayedprimerextension)——固相25焦磷酸测序法 (Pyrosequencing)DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)。原理:DNA聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。26基本步骤1.测序引物和DNA模板杂交(PCR扩增的、单链的),与酶和底物孵育。2.四

8、种dNTP(dATPS,dTTP,dCTP,dGTP)之一被加入反应体系,如与模板配对,与引物的末端形成共价键,dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。3.一系列的酶学反应,发出可见光信号。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。4.ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系。5.然后加入下一种dNTP。27282)连接酶联合链式反应(combinedchainreaction,CCR

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