实验技术原理.ppt

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1、SNPs的检测方法2007.4.121SNPs的定义定义：单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。(99.9%)2SNPs的研究意义1.SNPs作为第三代遗传标记（已知性、可遗传性、可检测性），用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。___路标的作用传统研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遗传学（表型、基因、蛋白），32.基因多态性研究研究SNPs本身对机体的影响（生理特征、病理条件下的千差万别）4SNPs

2、研究进展和方向1.SNPs数据库的构建发现2.SNPs功能的研究（在1的基础上）5SNPs检测方法1.理想的检测SNPs的方法——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs(1)灵敏度和准确度的要求（反应原理严紧）(2)快速、简便、高通量(操作和分析的自动化程度高）(3)费用相对低廉62.现状：到现在还没有一个符合以上条件的理想方法出现,但根据实际情况,可以选择出较合适方法。73.每种SNPs的检测方法都可将之看成由区分SNPs特异位点的原理方法和数据的检测分析手段两部分组成。8SNPs检测方法的分类一、区

3、分SNPs位点的方法1.基于杂交的方法2.基于酶的方法3.以构象为基础的方法4.直接测序的方法二、检测分析技术1.凝胶分析技术2.荧光检测技术3.DNA芯片4.质谱检测技术91.基于杂交的方法原理:短的核苷酸探针在和互补的目的片段进行杂交时，完全匹配和有错配两种情况下，根据杂交复合体稳定性的不同而将SNPs位点检测出来。（差异越大，检测的特异性就越好）101）利用△Tm固定温度等位基因特异核苷酸探针(Allele-specificoligonucleotide，ASO)。修饰过的探针：引入一个错配的碱基、

4、PNA、LNAs等动态的加热过程——动态等位基因特异杂交(dynamicallele-specifichybridization,DASH)11核酸肽探针（Peptidenucleicacids，PNA)其骨架是肽键特点：1、与靶分子高特异性地结合（3个方面的影响）2、链挤入（形成三链复合结构）（表达调控以及反义治疗方面）3、对核酸酶和蛋白酶均不敏感（体外应用）121、与靶分子高特异性地结合Tm值高受盐浓度影响小（低盐浓度的体系）△Tm更大（一个PNA碱基的错配会使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/

5、DNA的非特异结合能得到很好的排除。13LNA(lockednucleicacids)其结构是在RNA分子的2′羟基和核糖环的4′碳原子间连入一个亚甲基的“桥”。特点：1.能以很高的亲和性和互补的DNA、RNA或LNA结合（构象更利于杂交的稳定）2.匹配和不匹配的△Tm增加14DASH(dynamicallele-specifichybridization）152）杂交+荧光共振分子信标（双分子间杂交）蝎状探针（分子内杂交）16分子信标（Molecularbeacons）17蝎状探针（Scorpionpr

6、imer）182.基于酶的方法1）DNA聚合酶2）连接酶3）限制性内切酶4）外切酶FEN5）RNaseH191）DNA聚合酶等位基因特异性PCR多重等位基因特异性PCRTaqman法引物延伸法焦磷酸测序法20等位基因特异性PCR21Taqman法22微测序法/引物延伸法23基本步骤（液相）1.设计PCR扩增含SNPs位点的一段DNA2.对PCR产物进行纯化（去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）24APE

7、X(arrayedprimerextension)——固相25焦磷酸测序法(Pyrosequencing)DNA聚合酶、ATP硫酸化酶(ATPsulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)。原理：DNA聚合酶在一种dNTP的存在下进行引物延伸反应,而引物的成功延伸将伴随焦磷酸的释放,焦磷酸在荧光素酶的存在下能引一种发化学发光反应,通过发光计的实时监测来达到检测的目的。26基本步骤1.测序引物和DNA模板杂交（PCR扩增的、单链的），与酶和底物孵育。2.四

8、种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。4.ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。5.然后加入下一种dNTP。27282)连接酶联合链式反应(combinedchainreaction,CCR