fish实验技术一、技术原理

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1、FISH实验技术一、技术原理FISH技术是利用特异的DNA探针，标记了生物素，地高辛、或荧光素，对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交，并用荧光法显示。是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果迅速，并能在同一标本上检测多个不同的基因，可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。二、试剂配制：2.1变性液（70%甲酰胺+2×SSC，pH7.0）：4ml20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。2.2杂交后洗涤液：20×SSC4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。三、实验步骤1准备切片标本需在10%的中性福

2、尔马林固定24-48小时，切片厚度为4-5um，直接晾干，将玻片烤过夜,温度56-70℃。2脱蜡用钻石笔标出杂交区域，将切片浸入二甲苯中,10分钟×3次，室温，用100％的无水乙醇脱水，5分钟×2次，室温干燥，或在45-50℃的烤箱烤干，约2－5分钟。3蛋白酶处理3.1每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC40ml倒入Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。3.237℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。3.32×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。3.4梯度酒精脱水（-20℃预冷），空

3、气中干燥。4变性4.1每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；4.278℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；4.378℃孵育8min；4.4即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；4.5空气干燥。5杂交5.1准备探针；5.2取一个较大的湿盒，交叉放置切片；5.3滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；5.4盖上湿盒盖，37℃孵育12-16h。5.5杂交后水洗5.5.1镊子小心去除盖玻片；5.5.243℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；5.5.32×SSC（37℃）洗两次，每次

4、10min；5.5.4切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。5.6检测5.6.1从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。5.6.2每张切片使用30-60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；5.6.3去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。扩增：5.6.4从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；5.6.5每张切片滴30-60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；5.6.6去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色

5、缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；5.6.7从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；5.6.8每张切片滴30-60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；5.6.91×PBS室温下洗3次，每次2min。6细胞核染色6.1张切片加10-20μlDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2-5ml；6.2尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。7计数按一定方向移动玻片，计数细胞核内的信号。同一个细胞内，计数荧光点大小相近的信号，两个荧光点之间的距离小于等于信号直径的只能计数一个信号。核外的信

6、号以及只有一个颜色的细胞都不能计数。计数核内每个颜色的信号一个或一个以上的细胞。