FISH技术的基本原理.doc

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1、CISH的原理：将基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应使在光学显微镜下检测组织mRNA的表达水平。FISH技术的基本原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况。FISH就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体DNA进行杂交，经荧光检测体系对待测核酸定性、定位或相对定量分析的一种研究方法。试剂配制：(1)杂交增强液：取适量100倍杂交增强液与蒸馏水按1:99配制并放置冰箱备用(2)DAB显色液DAB底物和E和稀释液

2、D按1:50比例混匀。脱蜡及水化：组织经二甲苯2次，5min，无水乙醇3min，95%乙醇3min,80%乙醇脱蜡，以及水洗2min，蒸馏水洗2min2次。杂交预处理：将切片放入盛有1倍杂交增强液的容器里，微波高火煮2次，每15min加杂交增强液，并保证组织始终浸没于溶液中,自然冷却，流水冲洗，蒸馏水洗。杂交及变性：①加探针②加热变性③放置在杂交仪上培养过夜④浸没于PBS中，使盖玻片脱落⑤用PBS洗涤信号放大与显色：①小心擦去组织周围液体，加第一抗体②小心擦去组织周围液体，加第二抗体③小心擦去组织周围液体，加聚合物，室温培养，PBS清洗④擦去组织周围液体，加显色液体⑤流水冲

3、洗，PBS返蓝，梯度酒精脱水，中性树胶封固。结论是免疫组化表达初步筛查的首选方法检测法建议ICH阳性患者可进一步作显色法检测更有利于临床治疗方案的选择。