PCR-基础实验技术

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1、主要内容：PCR技术的基本原理PCR反应体系与反应条件PCR扩增产物的分析PCR产物克隆PCR常用优化策略PCR反应特点针对RNA酶的一些注意事项PCR污染分析及对策PCR常见问题分析PCR应用的部分简介原位PCR荧光定量PCR多重PCR定量PCRSSCPPCR定点突变应用实例PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94°C左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解

2、离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，在温度降至55°C左右时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个

3、循环，就可以把原来的样品精确地扩增了2的30次方倍。扩增产物的量可用下列公式表示:C=C0(l+P)no其中：C为扩增产物量,Co为起始DNA量,P为扩增效率,n为循环次数。在扩增后期,由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。每一循环经过变性、退火和

4、延伸，DNA含量可增加一倍（理论上）。对于某些扩增片段很短的PCR反应，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的吋间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60°C-65°C间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。iiiiiiiikliiiiliiiiliini1IIIIIHIIII1IIII；iiiiriiiiuiiiiiiHiiirunriiinIHtlllllllllIIIIIIIIIOI“n-n■吗何冉爼佇怙W11帕Dtu*r比迦is野片■trri前um牛吋lr;代令托MEllIllllllllllll

5、llliMIIIIrft.内备fiwLojuliiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiFbIIHillllllllllllllllllLojulPCR原理图TVTFrnT^rmrrmrrrr、生;‘4屮冲儿—、Jrwmfra胪幣C止fim繼uKm却T*llUuinriiijriMKiiliiiiiiiiiiiQimiiiiiiPCR反应体系与反应条件PCR反应体系试剂：1、反应缓冲体系：提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。冃前最常用的缓冲液是10〜50mmol/L的Tris-HCl(pH8.3〜8・8,20°

6、C),在72°C(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于6.8〜7.8之间。一般体系为：500mmol/LKC1、1Ommol/LTris-HCl(pH&4,20C)、150mmol/LMgCLTris-HCl用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KC1有利于引物与模板退火•高于50mmol/L的KCL,或50mmol/L的NaCl对TaqDNA聚合酶有抵制作用。2:在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200pnol/L时，Mg2+浓度为1

7、.5〜2.0mmol/L为宜。注意M^+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+,当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。M『+能影响反应的特异性和产率。M理浓度过髙丄反应竇垦性隆低-出现韭建呈扩壇，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。。此外，Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的牛.成等。由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg”结合从而降低Mg*的实际浓度。TaqDNA聚合酶在合成新DNA链

8、时,要求有游离的M『+,因而在PCR系统中确定Mg2+的最适浓度是必要的，故常需根据各自的实验预先试验,以确定本实验的最佳Mg2+浓度，保证DNA聚合酶具有良好的活性。通宣Mg2：的总量应比dNTP-0.2-2.5mmp]/L.o对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的M『+进行