蛋白质双向电泳及质谱技术.ppt

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1、蛋白质双向电泳及质谱技术蛋白质双向电泳技术双向电泳简介2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术。第一向—等点聚焦(IEF)pH梯度载体pI第二向—十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)SDS作为变性剂和助溶剂分子量样品等点聚焦(第一向)双向电泳的基本原理与流程示意分子量pH梯度(pI)SDS-PAGE两性电解质pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向双向电泳具体步骤样品制备缓冲液的配制IPG条重泡涨及上样第一向：IEFIPG条平衡平衡缓冲液Ⅰ(还原)平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)第二向：SDS-PAGE胶条染色成像及图像分析

2、为什么要进行样品制备目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。？1保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝

3、胶孔路。2最大限度减少样品的损失低温保存样品(一般需低于-86℃)尽量缩短处理时间除盐，省略不必要的过程保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。样品制备原则样品制备流程及注意事项溶解预处理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分级富集除杂样品的破碎原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解样品的来源易碎的细胞坚硬的组织植物细胞真菌方法温和剧烈温和破碎法渗透压冲击(培养的细胞)低渗液中的悬浮细胞反复冻融法(细菌)液氮冷冻去污剂降解(酵母、霉菌)降解缓冲液(含尿素和去污剂)SDS(应在IEF前去除)酶降解(植物、细菌、真菌)溶菌酶(细菌)纤维素酶

4、，果胶酶(植物)溶壁酶(酵母)剧烈破碎法超声破碎(细胞悬浮液)需以冰冷却避免过热弗式细胞压碎器(Frenchpressurecell，带壁微生物细胞在剪切力作用下破碎研磨(固体组织，微生物)液氮中将固体组织磨成细粉末样品研磨器(用于少量样品的处理)用于精确样品珠磨法(胞悬液，微生物)通过磨珠研磨破坏细胞壁作用去除杂质浓缩样品抑制蛋白酶活性关键-可溶性获得可以重新溶解的蛋白常用方法硫酸铵沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸铵/甲醇/苯酚抽提样品的沉淀对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白硫脲SDS新型两性表面活性剂(如磺基甜菜碱)样品中杂质

5、的去除去除原则尽量不丢失蛋白减少蛋白的修饰杂质的主要种类DNA/RNA脂质多糖盐离子去污剂其他固体杂质DNA/RNA的去除样品中含核酸的不利影响能被银染色法染色在凝胶酸性部分产生水平条纹当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀去除方法蛋白沉淀法DNase/RNase处理超声(机械破坏)、超高速离心DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)其他杂质的去除脂质使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI丙酮沉淀多糖阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH盐使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生透析；胶体过滤；

6、沉淀或重新悬浮离子去污剂如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，TritonX-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25%固体杂质阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦过滤样品的溶解2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一溶解的目标样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除溶解方

7、法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态增加样品溶解性的手段变性剂改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿表面活性剂溶解疏水基团离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS等还原剂使变性蛋白进一步伸展溶解含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB)起载体作用的两性电解质到达平衡位置形成pH梯度，“运载”电流、pH捕获样品中少量盐分浓度应小于0.2％（w/v，浓度过高会使IEF的速度降低)样品液的准备标准液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL0.1%原液

8、0.0002%溴酚蓝见下表0.2%两性电解质载体385mgDTT或500uL200mMTBP原液50mMDTT或2mMTBP24g尿素加入25mLH2O8M尿素用量试剂IPG用两亲性电解液的组成250l2