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1、毒理学杂志2007年6月第21卷第3期 JToxicolJune2007Vol121No13·231·[1,3]TG作用,这与袁淑云等报道用家兔作为降脂试验[2] 武井直树,李麒.纳豆在保健和医疗上的应用价值.中国动物的结果是一致的。本次试验同时显示纳豆胶囊毒微生态学杂志,2002,14:2432246.理学两阶段毒性实验结果为阴性[3] 段智变,江晓,江汉湖.纳豆粗提物抗兔高脂血症及抗氧,表明此胶囊为实际化作用的研究.营养学报,2004,26:2962299.无毒物质。[4] 刘宇峰,王金英,孙岸 ,等.纳豆激酶制剂—恩开胶囊参考文献的生产工艺中试研究.生物技术,20
2、00,10:48249.:[1]袁淑云.纳豆激酶粗提液对小鼠实验性高脂血症的降(收稿日期:2006-11-15)脂作用.现代医院,2005,15:10212.中图分类号:R144文献标识码:B文章编号:1002-3127(2007)03-0231-02·方法研究·放射性配体受体结合实验方法介绍班婷婷,吴强恩,周志俊(复旦大学公共卫生学院,上海200032)关键词:放射性配体受体结合法;经验介绍;方法小结 放射性配体受体结合(Radioligandreceptorbinding(CPM)值偏高。(2)用抽滤法分离放射性配体2受体复assays,RRA)实验广泛用于测定受
3、体的密度和亲和力,合物时,最好能预先寻找合适的滤膜冲洗时间。我们但是对初学者来说,要在本实验室建立RRA系统时,进行GABAA受体实验时发现5～6s分离较好,如图由于没有关于实验实际操作方面详细的介绍而倍感苦1。整个冲滤过程最好控制在20s以内。(3)滤膜最好恼,现根据我们实验室多年的经验,将部分内容方法操用体积分数为011%的聚乙烯亚胺(PEI)至少浸泡2h作步骤报道如下,以供同行参考。以上,目的是饱和膜上的非特异性结合位点。另外在使用时以新鲜浸泡为好,否则会使非特异性结合位点1 受体标本的制备和保存3重新暴露。表1为H2GABA实验中其他条件相同时,一般有差速离心和
4、蔗糖密度梯度离心,前者较为表1用不同浸泡液浸泡滤膜后所测数据,可见用体积常用。应在脱离正常供血环境后迅速在0～4℃条件分数为011%的PEI浸泡效果好。下匀浆。有报道,脑组织标本切成小块后以原状态冻存于-70℃～-80℃,能保存6个月以上,或者将组织块或所需组织的悬浮液保存在-70℃可保存6个[122]月,受体不失活。2 降低非特异性结合的方法3我们用组织提取受体进行H2GABA(γ2氨基丁酸)实验时,吸附在滤纸上的游离型标记配体的含量较多,非特异性结合很高,可考虑如下几方面降低其含量:图1不同冲洗时间对GABAA受体特异性结合的影响(1)加样顺序:最好先加膜受体饱和管
5、以壁减少33H2GABA在管壁上的吸附。若先加H2GABA则非特异性结合管所加入的非标记性配体会将管壁的3H2GABA3 决定在RRA系统所适用的受体P蛋白浓度由图2可见,为了寻找最大的特异结合点,向体系置换出来,而使非特异结合管的每min放射性计数中加入不同浓度的受体标本,随着受体浓度的增加其作者简介:班婷婷,硕士研究生,研究方向:农药毒理学。·232·毒理学杂志2007年6月第21卷第3期 JToxicolJune2007Vol121No13表1不同浸泡液浸泡滤膜后对GABAA受体特异性结合的影响滤膜浸泡液特异性结合的CPM(Pmin)体积分数为011%PEI833
6、15质量浓度为1%的BSA(牛血清白蛋白)38315质量浓度为5%的BSA45110011mmolPLGABA40915图3不同孵育时间对GABAA受体特异性结合的影响50mmolPLTris2HCI(缓冲液)545105 非标记配基浓度对特异性结合的影响特异结合也增加,但增加到某一程度其特异性结合的测定非特异结合的非标记配基浓度应当通过实验3增加开始钝化,由此可求出受体浓度2特异性结合的反合理选定。如测定不同浓度GABA对H2GABA结合的应曲线。一般取其直线部分的中央值作为RRA测定影响,得到如图4所示的曲线。低浓度时只有部分特时使用的受体标本浓度。但一般不主张用过
7、多的组织异结合被抑制,随GABA浓度增加抑制逐步增加,到达制备样本来增加受体浓度,因为制备标本时组织匀浆一定浓度时趋于平缓,该段表示特异结合完全被抑制,太浓会导致杂质不易去除。非特异结合是由非特异性蛋白、滤膜等所引起,具有容量大而亲和力低的特点,不被非标记配基抑制。但继续加大非标记配基的浓度,则特异结合也将被抑制,曲线又开始下降。合理的选择是平台部分。从图可见,-4实验时可以用浓度约为10molPl的GABA。图2不同蛋白浓度对GABAA受体特异性结合的影响4 孵育时间温度对RRA的特异性结合有影响。孵育一般在0～37℃环境下进行,用标记
