放射性配体与受体结合分析实验（rba）方法

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1、放射性配体与受体结合分析实验（RBA）方法刘星华2011-5-13药理室讲座内容实验定义与原理实验材料与仪器实验方法Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验）RBA的安全问题实验举例实验定义与原理定义放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassayofreceptors），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和力和受体的数量，以及研究受体亚型的常用方法。原理放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起温育，使受体和配基充分结合，形成受体-配基复合物，

2、终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。RBA的分类RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。1、定性RBA：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。2、定量RBA：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的受体数及结合的平衡解离常数或结合位点数（最大结合容量

3、）。实验材料与仪器实验材料动物组织（皮层、海马、纹状体等）仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、-80℃冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等）材料（2ml/6ml分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等）药品（放射性配基、各种非标计化合物等）实验仪器组织匀浆机IKA，T10BS25漩涡混合器WH-2低温高速离心机凯达，TGL20M超低温冰箱海尔数显恒温水浴锅金燕，HH-S26S制冰机GELIN型号IMS-50automaticiceflakes电热恒温水温箱循环水式多用真空泵液闪

4、测定计数仪HIDEX，425-034型实验材料2ml离心管6ml一次性软试管枪头1ml10ul200ulTrisPPO与POPOP过滤装置砂芯过滤装置（抽滤瓶）1000mlWhatmanGF/C玻璃微纤维滤纸40mm放射性化合物放射性配体低温保存实验方法流程实验方法流程1、制备受体样品；2、加样、温育进行结合反应；3、终止反应，分离结合物与游离物4、测定结合物的放射性；5、数据处理。实验具体操作（D1、D2、5-HT）1、配制各种缓冲液及试剂按处方配比配制各种缓冲液贮备液配制各种非标记配体溶液配制各种受试药物溶

5、液注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、EP管等试剂：无水乙醇、超纯水、Tris、抗血酸、优降宁、HCl、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、DMSO、甲苯、PPO、POPOP、Methysergide、Butaclamol及5HT等2、制备膜受体大鼠断头取脑分离出目标组织加10倍体积（V/W）冰冷的缓冲液用组织匀浆机匀浆3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液组织匀浆液用低温高超离心机离心（12000转/分）3次，每次20分钟弃上清液，沉淀（膜受体）放-80度超低温冰箱保

6、存备用注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机试剂：超纯水3、加样取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度按以下顺序及比例加入各种反应液。（1）总结合管：100ul膜受体+200ul缓冲液+10ul放射性配体（2）非特异管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul非标记配体+10ul放射性配体（3）受试物管：100ul膜受体+100ul缓冲液+100ul药物溶液+10ul放射性配

7、体注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：移液枪、烧杯、量筒、EP管等试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液4、受体配体结合反应以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育20分钟。20分钟后把各管放入冰中终止反应。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：恒温水浴锅，制冰机试剂：无5、分离游离及结合的放射性配体上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲液冲洗滤膜2次。滤膜放入85度烘箱中烘干，随后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：

8、抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪杯试剂：甲苯、PPO、POPOP6、测定结合型放射配体每分钟放射计数采用放射性计数仪，测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计数注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：液闪仪试剂：无7、数据处理按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：抑制率(I%)=（总结合管cpm—化合物cpm）/（总结合管cpm—非特异结合管cpm）×100%化合物每次实验做