鲈鱼mPEPCK表达载体的构建【开题报告+文献综述+毕业设计】

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1、本科毕业论文系列开题报告生物工程鲈鱼mPEPCK表达载体的构建一、选题的背景与意义鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)，也叫海鲈、花鲈、七星鲈，属于鲈形目，是一种广盐性的食肉食性鱼类，为常见的经济鱼类之一，也是发展海水养殖的品种，具有很高的经济价值。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK，EC4.1.1.32)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的第1个限速酶。PEPCK按照其在细胞内的定位不同分为2个亚型，即胞

2、浆型PEPCK和线粒体型PEPCK(分别用cPEPCK和mPEPCK表示)，它们有类似的动力学性能和大致相同的分子量，但编码的基因不同。cPEPCK是糖异生途径的重要限速酶，也是调节脂肪异生途径的关键酶。mPEPCK属于构成性表达，不受营养状态和激素的调节。目前对该基因的研究资料仅见于少数几种鱼，已分离克隆PEPCK基因cDNA全序列或部分序列的鱼有如下几种：虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、黑鲷(Acanthopagrusschlegeli)、斑马鱼(Daniorerio)、翘嘴红

3、鲌(Erythroculterilishaeformis)、大西洋鲑(Salmonsalar)、金头鲷(Sparusaurata)和鲤鱼(Cyprinuscarpio)等。PEPCK作为糖代谢中重要的限速酶，在鱼类利用碳水化合物的过程中起了重要的作用，相反这些酶的活性和表达也受到饲料中碳水化合物水平的影响。就目前国内外对一些鱼类的研究可知，碳水化合物对鱼类PEPCK的影响还没有统一定论。总之，对鱼类糖代谢酶的研究是比较复杂的，不同食性的鱼类以及同种鱼类不同的生长阶段、生长环境等都对其有不同的影响

4、。本研究从鲈鱼肝脏中分离克隆了PEPCK基因的cDNA序列，并将目的基因导入质粒中构建其表达载体，为今后的进一步研究PEPCK基因在糖代谢和脂代谢过程中的功能奠定了基础。本研究也可提供肉食性鱼类糖代谢特性的基础资料，可为今后人工养殖中饲料的选择提供依据，在水产养殖中具有一定的实际意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：本研究通过提取鲈鱼肝脏内的总RNA，根据获得的鲈鱼PEPCK基因及相应的限制性酶切位点设计合成引物来获取目的基因，并将目的基因导入到质粒中观察其表达。拟解决的问题有：鲈鱼肝脏内

5、总RNA提取问题；PCR扩增的最适条件以及如何根据获得的鲈鱼PEPCK基因及相应的限制性酶切位点设计合成引物。二、研究的方法与技术路线：1、鲈鱼肝脏总RNA的提取：使用Trizol法提取鲈鱼肝脏总RNA，经过加Trizol、组织匀浆、氯仿与异戊醇抽提等步骤，将提取的总RNA溶于焦碳酸二乙酯处理的灭菌水中，琼脂糖凝胶检测RNA的完整性，－80℃低温冰箱保存.2、RT-PCR合成cDNA并扩增编码基因：通过RT-PCR技术合成cDNA并扩增编码基因94℃下预变性4min；PCR循环为94℃下变性30

6、S，56℃下退火30S，72℃下延伸50S，总计34个循环；最后在72℃下延伸5min。3、目的基因的获取根据获得的鲈鱼PEPCK基因及相应的限制性酶切位点设计合成引物。并通过PCR扩增目的基因。PCR参数：94℃4min；94℃30S，56℃30S，72℃50S，循环30次；72℃5min，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，观察片段大小，并纯化PCR产物。4、表达载体的构建将纯化的PCR产物经双酶切后克隆进入同样经过双酶切的pET28a质粒中，获得重组质粒，转化为E.coliDH5α感受态

7、，筛选阳性菌株，测序。三、研究的总体安排与进度：2010年12月：实验前准备1.查询中英文资料、文献2.设计实验方案3.准备实验中所需的材料2011年2-4月：进行实验1.提取总RNA2.合成cDNA并获得PEPCK基因3．目的基因的获取以及表达载体的构建2011年5月上旬：撰写论文1.实验结果的整理、分析2.完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月中旬：准备答辩1.完成论文正稿2.准备毕业答辩二、主要参考文献：[1]戈贤平,俞菊华,吴婷婷,等.翘嘴红鲌PEPCK基因的克隆和序列分析［J］.中

8、国水产科学(GeXian-Ping,YuJu-Hua,WuTing-Ting,etal.MolecularcloningandcharacteranalysisofcDNAofphosphoenolpyruvatecarboxykinase(PEPCK)inErythroculterilishaeformis［J］.)JFishSciChina,2006,13(3):389-396.[2]HansonRW,ReshefL.Regulationofphosphoenolpyruvatecarbox