鲈鱼mPEPCK表达载体的构建【毕业设计】

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1、本科毕业设计（20__届）鲈鱼mPEPCK表达载体的构建目录1引言12mPEPCK表达载体的构建22.1实验材料和仪器22.1.1实验材料22.1.2实验中所用试剂盒22.1.3其他主要试剂22.1.4主要仪器22.2实验方法22.2.1鲈鱼肝脏总RNA的提取22.2.2肝脏常规cDNA的合成32.2.3鲈鱼mPEPCK开放阅读框片段的获取32.2.4PCR产物的纯化42.2.5重组质粒的构建和检测42.2.6鲈鱼pET-28a-mPEPCK的构建和筛选52.3结果62.3.1鲈鱼肝脏总RNA提取结果62.3.2鲈鱼mPEPCK开放阅读框片段62.3.3重组质粒的检测7

2、2.3.4pET-28a-mPEPCK双酶切82.3.5pET-28a-mPEPCK表达测序93讨论10致谢11参考文献11摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK,EC4.1.1.32)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的第1个限速酶。PEPCK作为糖代谢中重要的限速酶，在鱼类利用碳水化合物的过程中起了重要的作用，相反这些酶的活性和表达也受到饲料中碳水化合物水平的影响。就目前国内外对一些鱼类的研究可知，碳水化合物对鱼类PEPCK的影响还没有统一定论。本研究通过提取鲈鱼肝脏总RNA，逆转录为c

3、DNA,设计上下游引物获取mPEPCK的开放阅读框片段，大小为1908bp。将mPEPCK开放阅读框片段的PCR纯化产物与pMD-18T质粒进行连接，获得重组质粒。将重组质粒与pET28(+)质粒双酶切后用连接酶连接，最终获得pET-28a-mPEPCK。获得的表达载体pET-28a-mPEPCK可以用于深入研究mPEPCK，包括其在糖代谢、脂代谢中的重要功能，为体外研究mPEPCK的功能提供条件。关键词：鲈鱼；酶类；PEPCKAbstract:PEPCK(phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK,EC4.1.1.32)catalyt

4、icOxaloaceticacidtoPhosphoenolpyruvate,andit’sthefirstspeedlimitenzymeofgluconeogenicpathway.Asanimportantspeedlimitenzymeinsugarmetabolism,mPEPCKplayanimportantroleinfishusingcarbohydratesprocess.Instead,theexpressionoftheenzymeactivityandhavealsobeenfeedofcarbohydratelevelinfluence.Jus

5、ttosomefishathomeandabroadthestudyshowsthatthecarbohydratesaffectPEPCKfishinnounifiedconclusion.ThisstudyseparateandclonethecDNAsequenceofmPEPCKfromLateolabraxjaponicus,andusingtargetgenepayloadintotheplasmidtobuildit’sexpressionvector,laidingafoundationforitsfurtherstudyinsugarmetabolis

6、mandPEPCKgenesinthefunctionoflipidmetabolismprocess.Thisresearchcanprovidebasematerialofthesugarmetabolicfeaturesinpredatoryfish.Italsocanprovidesthebasisforchoosingfeedinartificialbreeding,andit’sbeofcertainpracticalsignificanceinaquaculture.Keywords:Lateolabraxjaponicus;enzymes;PEPCK1引

7、言磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK,EC4.1.1.32)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，是糖异生途径的第1个限速酶。PEPCK按照其在细胞内的定位不同分为2个亚型，即胞浆型PEPCK和线粒体型PEPCK(分别用cPEPCKmPEPCK表示)，它们有类似的动力学性能和大致相同的分子量，但编码的基因不同[1]。这2种亚型的PEPCK在细胞内的分布多少因物种和器官而异。在人和鸡中，cPEPCK和mEPCK的比例基本相同，在兔和仓鼠中，PEPCK的活性主要是mPEPCK，但是