两种奶牛结核病检测方法的比较研究

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1、两种奶牛结核病检测方法的比较研究　　摘要：牛结核病是由牛分枝杆菌引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病，严重威胁着人类的健康。因此，对该病的定期检疫对公共卫生和食品安全具有重大意义。本研究采用提纯结核菌素（PPD）皮内变态反应试验和y-干扰素（IFN-y）ELISA试验，对扬州市的892头奶牛进行结核病检测。结果表明，PPD皮内变态反应检出的31头牛型结核阳性牛和可疑牛中，经IFN-yELISA试验检测仅检出9头禽型结核可疑牛。PPD皮内变态反应试验特异性较差，出现了较高的假阳性率，其原因可能与禽结核分枝杆菌感染或其他非特

2、异性因素的干扰有关。　　关键词：结核病；结核菌素；y-干扰素；酶联免疫吸附测定　　牛结核病（Bovinetuberculo-sis，BTB），是由牛结核分枝杆菌（M.bovis）引起的一种人和多种家畜共患的慢性传染病，以组织器官的结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。在家畜中，以奶牛最为易感，其次为水牛、黄牛和牦牛。农业部将其列为二类动物疫病，卫生部将其列为乙类人间传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病。PPD皮内变态反应试验是OIE规定的金标准，在普查牛结核病中广泛使用，但其特异性较低，日常检

3、测中假阳性率较高。近年来，IFN-yELISA试验以其高特异性和灵敏度的优势，受到广大业内人士的关注。本研究旨在通过比较PPD皮内变态反应法和IFN-yELISA方法在检测奶牛结核病时的优缺点，为确定快速准确的奶牛结核病诊断方法提供参考，同时也为今后开展扬州市奶牛结核病的流行病学调查提供技术支撑。　　1.材料与方法　　1.1试验动物　　奶牛抗凝血样品来自2013-2015年度扬州市某区两个奶牛场，检测对象为两场全部青壮年牛和成年奶牛，3年合计检测数为892头（3年分别为272头、296头和324头）。　　1.2试剂　　牛

4、型提纯结核菌素（为黑龙江省生物制品一厂产品）；游标卡尺（0～150mm）（为上海量具刀具厂产品）。生化培养箱（HWS-250，为上海森信实验仪器有限公司产品）；生物安全柜（BSC-1500ⅡA2-X，为济南鑫贝生物技术有限公司产品），酶标仪（RT-6000，为深圳雷杜生命科学股份有限公司产品），IFN-y检测试剂盒（BovigamTM）（为PrionicsAG公司产品），刺激原禽型提纯结核菌素（PPD-A）和牛型提纯结核菌素（PPD-B）（均为瑞士Prionics公司产品）。　　1.3方法　　1.3.1PPD皮内变态反应

5、　　根据动物结核病诊断技术（GB/T18645-2002），用牛结核菌素0.1mL注射于牛的颈中部（左侧或右侧），分别于72h和120h进行两次观察，观察局部有无热肿胀痛的炎性反应，并量取皮皱厚度得出皮厚差。结果判定：以皮厚差大于4mm为阳性，2～4mm为可疑，小于2mm为阴性。凡检测为可疑的牛于检测后60d进行复检，复检后仍为可疑的牛判为阳性。　　1.3.2IFN-yELISA试验　　PPD皮内变态反应检测结果为阳性或可疑的牛，在30d后采抗凝血5mL，无菌条件下将抗凝血加入24孔细胞培养板（每份样品作3孔重复，1.5

6、mL/孔）；对应孔中分别加入100uL无菌PBS（作阴性对照）、刺激原禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素，抗原与分装的血液充分混匀后振荡1min，以上操作在采血后6h内进行；将加样完毕后的细胞培养板在37℃培养箱中孵育过夜（24h）；收集上清（不少于300uL）-20℃贮存待检。　　使用IFN-y检测试剂盒对样品进行检测，方法参照试剂盒说明书操作。　　2.结果与分析　　2.1PPD皮内变态反应检测结果　　3年间用PPD皮内变态反应共检测两个奶牛场样本892头，结核阳性和疑似的奶牛为31头（次），检测结果见表1，阴性牛数据

7、未列出。　　由表1可知：2013年两个奶牛场第1次检测有9头牛判定为结核阳性，其中A场有4头，B场有5头；有4头牛判定为可疑，其中A场有3头，B场有1头。然后对这4头牛进行了严格的隔离，相隔60d后进行了复检。复检由同一人操作，采用同样材料和方法，结果表明：这4头牛复检皮厚差均小于2mm，判定为阴性。　　2014年两个奶牛场第1次检测有3头牛判定为结核阳性，其中A场有1头，B场有2头；有13头牛判定为可疑，其中A场有7头，B场有6头。隔离60d后复检，结果表明：13头可疑牛中，有5条牛判定为可疑；有8头牛判定为阴性。　　

8、2015年两个奶牛场第1次检测有1头牛判定为结核阳性，属A场；有1头牛判定为可疑，属B场，隔离60d后复检，结果为阴性。　　通过连续3年的监测，发现A场PPD皮内变态反应检测结果阳性数分别为4、4、1头，其阳性率分别为2.56%、2.38%、0.55%；B场逐年监测的阳性数分别为5、4、0头，阳性率分别为4.31%、