两种血清抗性检测方法的比较分析

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1、两种血清抗性检测方法的比较分析摘要：采用流式细胞术法对大肠杆菌的血清抗性进行�z测，并与传统涂板法相比较，探讨流式细胞术在血清抗性检测方法中的应用。结果表明，两者呈正相关关系（P=0.034<0.05），流式细胞术法可以代替涂板法对大肠杆菌的血清抗性进行检测。该方法可以减少由于涂板不均匀、人工计数等造成的误差，且易操作、计算少、耗时少，数据更准确。中国8/vie　　关键词：血清抗性；涂板法；流式细胞术法　　中图分类号：S858.31文献标识码：A：0439-8114（2016）21-5571-03　　DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.2016

2、.21.033　　parisonandAnalysisofTResistanceTests　　XUedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China；　　2.AgriculturalCollegeofLiaochengUniversity，Liaocheng252059，Shandong，China）　　Abstract：FloetryandplatingmethodresistanceofEscherichiacoli.Theresultsshoetryandconventionalplatingmeth

3、od（P=0.034<0.05）.ThefloetrymethodcanreplaceplatingtotesttheserumresistanceofE.coli.Themethodcanreducetheerrorbeauseofunevenplatingandcountingbyeyes.Inparisonethod，thisfloetryhadlesscalculationandtakeslesstime，butaccuraterdata.　　Keyresistance；platingmethod；methodoffloetry　　大肠杆菌是自然环境中的常在菌，处

4、于温血动物肠道下段[1]，一般不会致病，但当饲养环境差，通风不好，营养缺乏或应激等情况出现会诱发鸡大肠杆菌病[2]。鸡大肠杆菌病的主要病型有腹泻、心包炎、眼炎、腹膜炎和输卵管炎、脐炎等[3]。鸡大肠杆菌病是集约化养殖厂经常发生的一类疾病，多危害雏鸡，死亡率为5%～50%[4]，造成经济损失。大肠杆菌致病过程为：大肠杆菌在呼吸道上皮或肠黏膜上皮黏附聚集定殖，进一步a侵染机体并增殖，再进入血液循环，形成全身性感染。当大肠杆菌进入血液后，将面对来自于血液如溶菌素、补体等物质的杀菌作用，此时大肠杆菌对血清的抵御能力将关系到其能否进一步扩大对宿主机体的感染程度。Iss基因（Incr

5、easedserumsurvivalgene，Iss）的作用是增强大肠杆菌在血清中的存活能力，是大肠杆菌的重要毒力基因之一[5]。此外，外膜蛋白也具有抵抗血清杀菌作用的能力[6]。有学者通过检测吸光度的变化来衡量大肠杆菌的血清抗性[7]，此种方法相对粗糙。通常都使用涂板的方法对大肠杆菌的血清抗性进行检测[8，9]，本研究提供一种基于流式细胞术的方法来检测大肠杆菌的血清抗性，与传统的涂板法进行比较来验证其可靠程度及优势。　　1材料与方法　　1.1菌株　　检测的20株大肠杆菌均为东北农业大学动物医学院保存菌株。　　1.2血清　　血清为SPF鸡血清。　　1.3染料　　LIVE/

6、DEADBacLightBacterialViabilityKits购自赛默飞世尔科技公司。　　1.4涂板法　　用接种环挑取平板上的单菌落，在LB液体培养基中37℃培养至对数期。取500μL菌液5000r/min离心2min，弃掉上清液，用生理盐水洗1～2次，重悬于0.9%的生理盐水，倍比稀释。再将100μL细菌悬液与400μL血清相混合，37℃温育2h，分别于0、2h取样平板计数。平行2次取平均值，计算2h与0h活菌数比值[10，11]。　　1.5流式细胞术法　　血清抗性检测通过流式细胞术进行检测，将大肠杆菌划线培养，挑取单菌落于液体LB培养基中振荡培养至约108CFU

7、/mL，然后离心，经生理盐水漂洗2次，并用PBS悬浮、倍比稀释。将100μL含有约107CFU大肠杆菌的稀释液加入含有SPF鸡血清的生理盐水溶液中（终浓度为10%），37℃水浴1h，12000r/min离心3min，弃上清，加入500μL生理盐水，再加入预先混合好的染料（A液∶B液=1∶1）1.5μL，混匀，避光染色15min，再通过流式细胞仪检测，检测结果用活菌数与全菌体比值。　　2结果与分析　　涂板法计算使用血清处理前后平板上活菌数的比值。流式细胞术法计算活菌和全菌体的比值。通过统计软件计算90%置信区间，流式细胞术法结果