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时间:2019-08-04
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1、两种奶牛结核病检测方法的比较研究 摘要:牛结核病是由牛分枝杆菌引起的一种人兽共患的慢性消耗性传染病,严重威胁着人类的健康。因此,对该病的定期检疫对公共卫生和食品安全具有重大意义。本研究采用提纯结核菌素(PPD)皮内变态反应试验和y-干扰素(IFN-y)ELISA试验,对扬州市的892头奶牛进行结核病检测。结果表明,PPD皮内变态反应检出的31头牛型结核阳性牛和可疑牛中,经IFN-yELISA试验检测仅检出9头禽型结核可疑牛。PPD皮内变态反应试验特异性较差,出现了较高的假阳性率,其原因可能与禽结核分枝杆菌感染或其他非特
2、异性因素的干扰有关。 关键词:结核病;结核菌素;y-干扰素;酶联免疫吸附测定 牛结核病(Bovinetuberculo-sis,BTB),是由牛结核分枝杆菌(M.bovis)引起的一种人和多种家畜共患的慢性传染病,以组织器官的结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。在家畜中,以奶牛最为易感,其次为水牛、黄牛和牦牛。农业部将其列为二类动物疫病,卫生部将其列为乙类人间传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病。PPD皮内变态反应试验是OIE规定的金标准,在普查牛结核病中广泛使用,但其特异性较低,日常检
3、测中假阳性率较高。近年来,IFN-yELISA试验以其高特异性和灵敏度的优势,受到广大业内人士的关注。本研究旨在通过比较PPD皮内变态反应法和IFN-yELISA方法在检测奶牛结核病时的优缺点,为确定快速准确的奶牛结核病诊断方法提供参考,同时也为今后开展扬州市奶牛结核病的流行病学调查提供技术支撑。 1.材料与方法 1.1试验动物 奶牛抗凝血样品来自2013-2015年度扬州市某区两个奶牛场,检测对象为两场全部青壮年牛和成年奶牛,3年合计检测数为892头(3年分别为272头、296头和324头)。 1.2试剂 牛
4、型提纯结核菌素(为黑龙江省生物制品一厂产品);游标卡尺(0~150mm)(为上海量具刀具厂产品)。生化培养箱(HWS-250,为上海森信实验仪器有限公司产品);生物安全柜(BSC-1500ⅡA2-X,为济南鑫贝生物技术有限公司产品),酶标仪(RT-6000,为深圳雷杜生命科学股份有限公司产品),IFN-y检测试剂盒(BovigamTM)(为PrionicsAG公司产品),刺激原禽型提纯结核菌素(PPD-A)和牛型提纯结核菌素(PPD-B)(均为瑞士Prionics公司产品)。 1.3方法 1.3.1PPD皮内变态反应
5、 根据动物结核病诊断技术(GB/T18645-2002),用牛结核菌素0.1mL注射于牛的颈中部(左侧或右侧),分别于72h和120h进行两次观察,观察局部有无热肿胀痛的炎性反应,并量取皮皱厚度得出皮厚差。结果判定:以皮厚差大于4mm为阳性,2~4mm为可疑,小于2mm为阴性。凡检测为可疑的牛于检测后60d进行复检,复检后仍为可疑的牛判为阳性。 1.3.2IFN-yELISA试验 PPD皮内变态反应检测结果为阳性或可疑的牛,在30d后采抗凝血5mL,无菌条件下将抗凝血加入24孔细胞培养板(每份样品作3孔重复,1.5
6、mL/孔);对应孔中分别加入100uL无菌PBS(作阴性对照)、刺激原禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素,抗原与分装的血液充分混匀后振荡1min,以上操作在采血后6h内进行;将加样完毕后的细胞培养板在37℃培养箱中孵育过夜(24h);收集上清(不少于300uL)-20℃贮存待检。 使用IFN-y检测试剂盒对样品进行检测,方法参照试剂盒说明书操作。 2.结果与分析 2.1PPD皮内变态反应检测结果 3年间用PPD皮内变态反应共检测两个奶牛场样本892头,结核阳性和疑似的奶牛为31头(次),检测结果见表1,阴性牛数据
7、未列出。 由表1可知:2013年两个奶牛场第1次检测有9头牛判定为结核阳性,其中A场有4头,B场有5头;有4头牛判定为可疑,其中A场有3头,B场有1头。然后对这4头牛进行了严格的隔离,相隔60d后进行了复检。复检由同一人操作,采用同样材料和方法,结果表明:这4头牛复检皮厚差均小于2mm,判定为阴性。 2014年两个奶牛场第1次检测有3头牛判定为结核阳性,其中A场有1头,B场有2头;有13头牛判定为可疑,其中A场有7头,B场有6头。隔离60d后复检,结果表明:13头可疑牛中,有5条牛判定为可疑;有8头牛判定为阴性。
8、2015年两个奶牛场第1次检测有1头牛判定为结核阳性,属A场;有1头牛判定为可疑,属B场,隔离60d后复检,结果为阴性。 通过连续3年的监测,发现A场PPD皮内变态反应检测结果阳性数分别为4、4、1头,其阳性率分别为2.56%、2.38%、0.55%;B场逐年监测的阳性数分别为5、4、0头,阳性率分别为4.31%、
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