鱼类肠道微生物种群鉴定

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1、材料与试剂实验材料每种鱼随机各取5条，均选取正常无病的个体。取样时用抄网迅速将鱼从水体中捞出，剪刀敲击头部致死后，将鱼置于灭菌塑料密封袋内，保存在冰盒中，3h内转移到实验室，12h内处理鱼样。鱼肠道的处理(1)在无菌操作台上进行血样处理，先用75%酒精擦拭鱼体表，用解剖剪沿肛门向上剪开；(2)肠道用无菌棉线分别结扎肠段，75%酒精擦拭消化道外壁，用银了去除附着表而的脂肪；(3)剖开肠道后轻轻收集每尾鱼的内容物，混匀；-20°C保存待用;用磷酸盐缓冲液(pH7・2)轻柔漂洗试剂磷酸盐缓冲液(pH7.2)琼脂糖Tris平衡酚分析纯

2、生化试剂和PCR反应引物TaqDNA聚合酶、dNTP等分子生物学试剂_DNA分子量标准(DL100和500)蛋白酶KJM109感受态pMD18—T异丙基硫代半乳糖昔(IPTG)DNA酶CTAB方法1肠道细菌总DNA的捉取使用无菌的牙签将肠道划开，剥取里而的肠道糜烂物。收集5个个体的肠道糜烂物，混合后作为这种鱼的代表样品。采用QIAamPRDNAstooIMiniKit试剂盒提取样木的总DNA。总DNA溶解于100微升超纯水中。_2PCRDGGE分析采用引物P2(5,ATTACGAGGAGCAG3,)扩增16SrRNA基因的V3

3、区。25微升反应体系包括25微升的10*Buffer,2微升的25mmol/LdNTP混合物，1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa,Japan)M种引物25pmol,l微升总DNAoPCR反应程序如下：94°C变性4min进入30个循环，循环为94°C45s,55°C45s,72°CImino最后是lOmin延伸。然后进行"ReconditioningPCR”。2次PCR中均采用超纯水作为阴性对照保证PCR过程屮没有污染。PCR经过琼脂糖电泳检查后，使用HoeferDyNAQuant200system确定DNA的浓度。DGGE

4、指纹图谱的构建釆用BioRadDcodemutationdetectionsystem进行。丙烯酰胺凝胶浓度为8%,变性梯度为25%-55%(100%变性剂为7mol/L尿索和40%去离子甲酰胺),PCR产物的上样量为每个泳道约300ngo在200V、60C条件下电泳160mino电泳后凝胶使用10000倍稀释的SYBRGreenI进行染色。最后使用UVIphoto照相系统进行紫外照相。样品前处理将采集的5组样品分别用1.5mLPBS(pH7.4,浓度0.2mol/L)悬浮，剧烈震荡5min后，1000r/min离心3次，每次

5、5min,收集上清，然后12000r/min离心5min,收集菌体沉淀，用1mlPBS悬浮沉淀，重复离心，直到上清液清澈为止；最后再用1mlPBS悬浮收集到的沉淀，置于2mlEppendorf管屮・20°C保存备用。总DNA的提取(1)在上述处理的样品小齐加入180uLTE缓冲液再加入50nig/inL的溶菌酶20uL,混匀后置30°C温育最少15mino(2)12000r/min离心5min收集已消化细胞壁的细菌。(3)加入200nLBufferBTL重悬细胞加25uL蛋口酶K(15mg/mL)加入玻璃珠，涡旋混匀，置于55

6、°C恒温水浴，每20-30min涡旋振荡样品1次。裂解时间随细菌的种类及用量的不同而不同但一般在1h之内就能消化完全。(4)加入25mg/mL的RNA酶A5订,并在室温下放置5min。(5)加入220pLBufferBDL,涡旋混匀，并在65°C下水浴10min。在加入BufferBDL后可能会形成小团的沉淀并不会影响DNA的提取。(6)加入220uL无水乙醇并充分地涡旋振荡。(7)把Hibind自旋柱装在1个2mL收集管上耙第6步得到的样品(包括可能形成的所有沉淀)全部转移到柱子内10000Xg离心lmin以结合DNA乔去流

7、出液和收集管。(8)把柱子装到1个新的2mL收集管上，加入500nLHB加入700uLDNAWashBuffer(已用无水乙醇稀释)于柱子屮10000Xg离心1min以洗涤柱了养去流出液，收集管再继续下一步使用；柱了重新套回2mL收集管，加入700pLDNAWashBuffcrlO000Xg离心1min以洗涤柱子苏去流出液。(9)柱子重新套回2mL收集管，三10000Xg离心空柱2min以世干柱子；这一步对确保下步屮得到最理想的洗脱条件是至关重要的。(10)把柱了套在1.5mL离心管中，加入100订65°C预热的TE(pH8.

8、5)至柱子的膜中央，室温下放置5mine(11)室温下10000Xg离心1min从柱子上洗脱出DNA0PCR扩增凝胶电泳DGGE电泳凝胶制备(1)灌胶玻璃和垫条的处理:用洗洁液仔细清洗玻璃板，横擦竖擦3遍，并用自来水彻底冲洗然后用去离子水漂洗干净。操作时必须带手套，取板时握住