肠道微生物DNA提取

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1、土壤微生物中提取总DNA实验概要从土壤微生物中提取总DNA并纯化，高质址的DNA可用于后续文库构建。主要试剂TENP缓冲液(50mmol/LTris,20mmol/LEDTA,100mmol/LNaCI,1%PVP,pH10.0)PBS缓冲液(137mmol/LNaClz2.7mmol/LKCI,10mmol/LNa2HPO4/2mmol/LKH2PO4/pH7.4)DNA提取缓W1液(100mmol/LTris,100mmol/LEDTA,100mmol/LNa3PO4/1.5MNaCI,1%CTAB,pH8.0)蛋白酚K

2、(25mg/mL)溶菌酶(50mg/mL,pH8.0)20%SDS氯仿异戊醇异丙醇70%乙醇RNAse20mg/mLQIAXII大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)主要设备50mL、1.5mL离心管摇床高速离心机水浴锅电泳槽电泳仪涡旋仪实验材料土壤样品实验步骤1.总DNA提取：(1)収2g土样，置于50mL灭菌的离心管中；(2)加入10mLTENP缓冲液(50mmol/LTris,20mmol/LEDTA,100mmol/LNaCI,1%PVP,pH10.0)悬浮土样，200转摇床振荡lOrnin充分混匀；(3)10000r

3、/min离心5min,弃上淸，重复洗涤多次至上淸基木为无色；(4)用5mLPBS缓冲液(137mmol/LNaCI,2.7mmol/LKCI,10mmol/LNa2HPO4/2mmol/LKH2PO4/pH7.4)漂洗一次；(5)沉淀加入13.5mLDNA提取缓冲液(100mmol/LTris,100mmol/LEDTA,100mmol/LNa3PO4/1.5MNaQ1%CTAB,pH8.0),混匀后加入100pL蛋白酶K(25mg/mL)和200yL溶菌酶(50mg/mL,pH8.0),37°C水浴30min,每隔10mi

4、n颠倒混匀;(6)加入2mL20%SDS,65°C水浴2h,每隔20min颠倒混匀;(7)8000r/min室温离心15min,取上清，用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次;(8)水相屮加入0.6倍体积的异内醇，4°C沉淀过夜；(9)11000r/min4°C离心20min收集DNA沉淀；(1)70%乙醇漂洗两次,干燥后用100

5、1LddH2O(含RNAse20mg/mL)溶解,转入1.5mL离心管。1.总DNA纯化：(1)配制0.8%琼脂糖凝胶；(2)每个上样孔加入50

6、1L粗DNA,进行低电压长时间电泳(4°C,25

7、V,8h)；(3)电泳结束后，切下主带所在的凝胶(胶的体积尽对能小)；QIAXII大片段凝胶回收试剂盒(Qiagen)回收:加入3倍体积的BufferQXI及适量的QIAXII(Glassmilk),55°CiU浴10min,每隔2min轻轻用手指弹起沉淀(回收人片段时不要涡旋)，待凝胶完全溶解，12000g离心1min,弃上清;再加入500

8、1LBufferQXI洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶:再用500pLBufferPE洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上淸，琼脂糖凝胶电泳确定冋收效率。肠道微生

9、物DNA的提取实验概要肠道微生物DNA是进行微生物分子生态学研究的前提。能否获得高的DNA提取率和高质量的DNA,从而真实地反映微生物群落的实际情况，是保障研究结果是否可靠的关键。如何获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA是肠道微工物研究中的关键。木研究采用物理方法，化学方法，酶解法等进行DNA提取，并对其进行比较，经过优化得到最佳的提取方法，使其符合以后PCR扩增要求以及其它后续研究工作。试验结果表明用液氮研像加CTAB提収液的方法提収的肠道微牛物总DNA的效果高于其它方法。并口通过电泳以及PCR检测,所提取的DNA的质

10、量适于进一步的分了生物学研究。实验材料健康成年对虾购于市场，挑取生氏较好、大小均一的，于超净台下取肠道，无菌操作。实验步骤1.DNA提取方法方法A：1)取0.02g虾肠加入总filmLPBS匀浆,液氮研磨2)加入250uL0.5%Tween-80,吹打洗脱3min3)300g离心5min,取上清4)10000g离心lOmin,弃上清5)加入250ULDNA裂解液，涡旋混和器上混合30s6)65°C水浴20min,期间每5min混合一次7)12000g离心15min,取上清8)加等体积酚/氯仿,14000g离心15min,取上

11、清9）加入2.5倍体积异丙醇,-20°C静置l-2h10）4°C14000g离心15min,弃上清11）加入300uL70%预冷乙醇,14000g离心lOmin,弃上清12）超净台下干燥，力口50ULTE重悬，冻于・80C方法B：1）取0.02g虾肠，加130ULCTAB提取液，冰浴超声1