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1、细菌基因组DNA的提取方法综述1快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min,丢去上清夜，收集菌体。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离
2、心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4oC保存备用。2蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用WashingTE（50mmol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯
3、酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。31)细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2)细菌收集：取1ml培养物于1.5mlEP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mlTE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。3)菌体裂解：加入6μl50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，1
4、0%SDS110μl，20mg/ml的蛋白酶K3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4)抽提：菌液均分到两个1.5mlEP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5)沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7)抽（凉）干后，溶于50μlddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模
5、板用。4DNAEXTRACTIONPROCEDURE-GENERAL1)Growcellsovernightin500mlbrothmedium.2)Pelletcellsbycentrifugation,andresuspendin5ml50mMTris(pH8.0),50mMEDTA.3)Freezecellsuspensionat-20C4)Add0.5ml250mMTris(pH8.0),10mg/mllysozymetofrozensuspension,andletthawatroomtempera
6、ture.Whenthawed,placeonicefor45min.5)Add1ml0.5%SDS,50mMTris(pH7.5),0.4MEDTA,1mg/mlproteinaseK.Placein50Cwaterbathfor60min.6)Extractwith6mlTris-equilibratedphenolandcentrifugeat10,000Xgfor15min.Transfertoplayertonewtube(avoidinterface).Re-dothisstepifnecessa
7、ry.7)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).SpooloutDNAandtransferto5ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA,200g/mlRNase.Dissolveovernightbyrockingat4C.8）Extractwithequalvolumechloroform(mixbyinverting)andcentrifugeat10,000Xgfor5min.Transf
8、ertoplayertoanewtube.9）Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).10）SpooloutDNAanddissolvein2ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA.11）CheckpurityofDNAbyelectrophoresisandspectrophotomet
