行业标准：DB37T 4092-2020 鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求.pdf

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1、ICS07.100B50DB37山东省地方标准DB37/T4092—2020鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求Thegeneraltechnicalrequirementsofseparationandidentificationoffishintestinalmicroorganism2020-08-20发布2020-09-20实施山东省市场监督管理局发布DB37/T4092—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋局提出并组织实施。本标准由山东省海洋标准化技术

2、委员会归口。本标准负责起草单位：青岛华大基因研究院、青岛市标准化研究院。本标准主要起草人：刘姗姗、乔雪松、王裕宽、王萌萌、杨恒加、王琛、陈建威、苏小珊、翟越、许静、赵丹。IDB37/T4092—2020鱼类肠道微生物分离鉴定通用技术要求1范围本标准规定了鱼类肠道微生物样本的采集、分离、培养、鉴定及保藏等。本标准适用于淡水及海水鱼类肠道微生物的研究。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单

3、）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T30744深海微生物样品前处理技术规范SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1肠道微生物intestinalmicroorganism生长于动物肠道，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。3.216SrDNA是编码16SrRNA的基因，16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，是系统分类研究中最常用的分子标签，可被用于菌种鉴定。3.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction

4、一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA/RNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。3.4Sanger测序Sangersequencing即双脱氧链终止法测序，为第一代DNA测序技术，是一种常用的核酸测序技术，用于DNA分析，由英国生物化学家弗雷德里克•桑格于1977年发明。4缩略语1DB37/T4092—2020下列缩略语适用于本文件。PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

5、OD：光密度（OpticalDensity）5基本要求5.1实验室通用要求实验室应满足GB19489中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。5.2鱼类样本要求鱼类样本应尽量保证鲜活，死亡鱼类样本最长死亡时间不应超过24h。5.3实验用具准备一次性无菌手套、无菌眼科镊、无菌眼科剪、无菌PBS（配方见附录A.1）、2216E培养基(配方见附录A.2)、LB培养基（配方见附录A.3）、无菌水、无菌50mL离心管、医用托盘、75%消毒酒精、涂布棒等。6鱼类肠道微生物样本采集和保存6.1鱼类肠道微生物样本采集与

6、储存6.1.1活体鱼类样本应先进行麻醉，之后，在超净工作台内，用75%的酒精对鱼体擦拭消毒。6.1.2将鱼类样品从泄殖腔处沿腹部剖开，用无菌PBS冲洗鱼类腹部，用吸水纸擦拭腹腔。6.1.3分离并剪下鱼类完整肠道，将肠道内容物全部挤到无菌离心管中，并将肠道内壁残留物轻刮于离心管中。6.1.4对肠道内容物进行称重，内容物总质量应控制在10g以下，按1g内容物加入3mL无菌PBS的比例进行稀释，震荡混匀，得到肠道微生物样本。6.2肠道微生物样本存储肠道微生物样本应储存在2℃～8℃低温环境下，宜立即进行处理，保

7、存期限不应超过一周。7鱼类肠道可培养微生物的分离、培养及鉴定7.1肠道微生物分离和纯化7.1.1肠道微生物分离-17.1.1.1取100μL肠道微生物样本，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10样品稀释液，震荡混匀，备用。-1-27.1.1.2取100μL10样品稀释液，用无菌PBS稀释到1000μL，制成10样品稀释液，震荡混匀，备用。-3-47.1.1.3按上述步骤依次稀释获得10、10的样品稀释液，震荡混匀，备用。2DB37/T4092—2020-2-3-47.1.1.4取10，10，10样品稀

8、释液进行固体培养基平板涂布，涂布平板宜28℃恒温培养，培养时间1～3天，每隔12h观察菌落生长状态。7.1.2肠道微生物纯化7.1.2.1观察涂布平板的生长情况及菌落形态特征，选择合适稀释度（约10～200个菌落）的平板挑选菌落，选择不同形态的单菌落编号后划线，于28℃恒温培养12h～24h。7.1.2.2观察划线培养菌落形态特征是否单一，对于形态结构不单一的平板继续挑单菌落并划线培养，直至获得菌落形态特征一致的纯培养单菌，并填写《菌落形态