生物化学实验 层析法实验

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1、实验二（1）凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白【实验目的】掌握凝胶层析分离蛋白质的基本原理，掌握柱层析的基本操作方法【实验原理】交联葡聚糖凝胶具有多糖网状结构，血红蛋白较鱼精蛋白大：血红蛋白分子量为64500，鱼精蛋白分子量为2000-12000，因此在交联葡聚糖凝胶中鱼精蛋白从胶体分子内部网状结构孔隙中通过，血红蛋白从胶体分子间隙中通过。血红蛋白走过的路径短且速度快，鱼精蛋白走过的路径长且速度慢。因此可以在层析柱中观察到红色的血红蛋白先被洗脱出来，而经二硝基氯苯预染呈黄色的鱼精蛋白则在其后被洗脱出来【实验步骤】检查层析装置是否完好→装填层析柱（蒸馏水面应高凝胶面1cm左

2、右）→滴加0.2ml的血红蛋白和鱼精蛋白混合样品→放出一些蒸馏水使样品沉降到凝胶表面→滴加蒸馏水至液面高凝胶2cm→开始洗脱，过程中应不断滴加蒸馏水使液面高度尽量保持不变【实验结果】如图所示：【讨论与分析】1.凝胶层析柱装填时应避免出现气泡，因为气泡会导致血红蛋白的洗脱路径变窄，以至于血红蛋白洗脱速率减慢，从而导致血红蛋白和鱼精蛋白分离不充分；2.为避免凝胶柱装填时出现分层现象，可在再次加入凝胶前轻轻吹打沉淀好的凝胶表面，然后再慢慢补加凝胶。实验二（2）离子交换层析分离混合氨基酸【实验目的】掌握离子交换层析的基本原理，了解分离混合氨基酸的基本方法【实验原理】天冬氨酸的

3、等电点是2.97，赖氨酸等电点为9.74。所以先用pH4.2的柠檬酸洗脱时天冬氨酸带负电被洗脱出来，而赖氨酸带正电吸附在阳离子交换树脂上；然后用pH13的NaOH洗脱时赖氨酸带负电，此时之前被吸附在阳离子交换树脂上的赖氨酸就会脱落而被洗脱出来了。【实验步骤】检查层析装置是否完好→装填层析柱并用柠檬酸洗涤几次阳离子交换凝胶（流动相面始终应高出凝胶面1cm左右）→滴加0.2ml的混合氨基酸样品→放出一些液体使样品沉降到凝胶表面（使流动相液面高出凝胶面0.5cm即可）→滴加柠檬酸至液面高凝胶2cm→开始洗脱并用标记好的试管依次采集7管洗脱液各2ml（过程中不断滴加柠檬酸使液

4、面高度尽量保持不变）→换用NaOH洗脱，同样也采集7管洗脱液各2ml→往洗脱液收集管中分别加入pH为5的乙酸缓冲液和茚三酮溶液各0.5ml→沸水浴10min→570nm测吸光值→绘制层析图并计算分离度【实验结果】时间（试管编号）1234567吸光度A0.0000.0040.6950.2950.0440.0140.030时间（试管编号）891011121314吸光度A-0.0030.0080.0373.0100.2220.0200.039【讨论与分析】由层析图可得Rs=98.4%【讨论与分析】天冬氨酸与赖氨酸洗脱液的吸光度差距较大的原因可能有哪些？答：1.样品取自上清液

5、，氨基酸没有混合均匀，导致洗脱液中氨基酸含量差异较大；2.茚三酮与氨基酸的呈色反应的结果与氨基酸的种类及pH值有关，洗脱液pH值不同，导致茚三酮呈色反应出现了不同的染色结果因而导致了吸光度的差异。