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《生物化学实验一氨基酸聚酰胺薄膜层析DNS-Cl法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验一氨基酸聚酰胺薄膜层析DNS-C1法13生物基地201300140059刘洋2015-03-24同组者：张奕一、实验目的1.了解并掌握DNS＜基酸的制备和鉴定。2.掌握制备Dansyl氨呈酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。二、实验原理CH—COO-RNH荧光试剂5•二甲氨基亠蔡碱酰氯（dansyl-CI,简称DNS-CI）在弱碱性条件（pH9.0左右下与氨基酸（肽或蛋白质）的u■氨基结合成带有黄绿色荧光的DNS■氨基酸：+HC1RICH—COOH其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨慕酸可纶成双DNS■氨-基酸衍生物。这些衍工物相当稳定，可用于蛋白
2、质的氨棊酸组成的微量分析，灵敏度可达10-10〜10-9mol,比苗三酮法高10倍以上，比过去常'用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起來（称为Edman-DNS法）应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提MEdman法的灵敏度及其分析速度。DNS-CI在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH：CHDNS-CIchK严NH-H2ODNS-OHHCiKiRi
3、<>H^DZSZH.DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光,可彼此区分开。DNS・氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测
4、灵敏度为O.Olugo由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析工作中。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差界（如吸附力、分子形状及大小、分了亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）屮的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各纟fl分以不同的速，从度移动而达到分离的目的。聚酰胺是一类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成，又称锦纶66o因这类物质的分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚
5、酰胺的一C=0及〉NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类（包括黄酮类、糅质等）和酸类（如核计酸、氨基酸等）是以梵基与酰胺键的拨基形成氢键；硝基化合物和酿类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成轼键能力的强弱，决定了吸附能力的差异。在层析过程中，溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表血之间的分配系数能有较人秀异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。三、实验器材层析缸（1OcmX20cm）,聚酰胺薄膜（7cmX7cm）,电吹风，紫外灯（波长254nm或265nm）,移液枪，量筒，吸管。四、实
6、验试剂1.DNS-C1丙酮：50ml2.5mg/ml2.缓冲液:pH9.9N&C0厂NaHCOa3.氨慕酸溶液：内氨酸、苯内氨酸、赖氨酸、混合氨棊酸4.展层液卬酸：水=1.5：100（现用现配）五、实验步骤1.DNS-CI标记：取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul,再各加入30UIDNS-CI丙酮溶液，混合均匀示置于37°C水浴屮1小时。2.点样：在距聚酰胺薄膜底端0.5-lcm处用铅笔画-•条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm,重复2-3次，每次点完用电吹风冷风吹干，最多不宜超过5次
7、；3.展层：1）配制展层液100ml,V（甲酸）：V儀®zK）=1.5:100o2）将展层液置丁•培养皿盖（加12・13ml）或底（加10ml）中，将己点样的聚酰胺薄膜光面向外用皮筋套成圆柱形，并使具两端不接触，之后放入展层液屮，盖上500ml烧杯。3）待展层液上升到距顶端大约5mm时展层结束，将其取出，冷风吹下。4.透射：将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出，并计算Rf值进行比较。六、实验结果丙氨酸苯丙氨酸赖氨酸混合氨基酸■丙氨酸：Rf=0.55■苯丙氨酸：Rf=0,26■赖氨酸：带1Rf=0.14,带2RML■混合氨基酸：带lR
8、f=0.14,带2Rf=0.26,带3Rf=0.63,带4Rf=l因此对以推测，混合氨基酸成分为丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。七、注意事项1•在实验操作小应注意不要污染聚酰胺薄膜。用手拿层析薄膜时不能接触无光泽-•面,不能使其沾水，以防污染薄膜，造成实验结果不梢确。2.在薄膜上画直线时，耍注意轻画，否则对能会划破薄膜上的纤维，造成在层析时样品一部分无法上行，影响蝕后实验结果。2.点样时点样时毛细管碰一下薄膜即可，若接触时间过长会使点样的直径过大，点样直径不能超过加m。点样间的间距控制在1到1.5cm,太近可能会有样站重叠。4•点样时还耍注意必须吹干后才能进行
9、下一次点样，否则会使点样半径过大，使层析后的最后形状走样。5.层析时要注意薄膜边
