生物化学实验10凝胶过滤层析

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1、实验十凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶一、目的要求1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化二、原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。内水体积Vi外水体积Vo柱床体积Vt洗脱体积VeVt=Vo+Vi+VgVe=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/ViKd=0Kd=101优点：a.条件温和b.操作简便c.损失少回收率高d.层析柱可反复使用凝胶的类型：Sephadex:交联葡聚糖S

2、epharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000凝胶及柱的选择凝胶的处理及装柱凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡

3、聚糖检查、平衡装柱时要注意操作压。装柱的两种方法：a.手工操作1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶b.电动搅拌下的装柱法（如图4-9）样品上柱分析用量：柱床体积的1—2%制备用量：柱床体积的10—20%洗脱收集部分收集器、核酸蛋白检测仪凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰应用a.分离蛋白质b.脱盐c.蛋白质分子量的测定三、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正

4、确，插上电源插头。2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到“通”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。记录仪量程调在10mV档上。3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到100％T档。4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节“光量”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置5mV左右数字显示为50左右。仪器开机稳定时间大约在1小时左右，待基线平直后，可加样测试。5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量

5、程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0”，同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在"0"位。6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。记录仪光吸收A读数当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记

6、录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半(50%刻度)位置时即为0.25A。数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式)当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为:A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数AA量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A部分收集器的操作方法1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和“停”;使定时时间为零，放开“停”按

7、“快”或“慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢"和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下“秒”键。2．定位，将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或“顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在“顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴

8、臂口对准第一根试管即可。移液器（俗称“枪”）的使用：四、操作方法（一）凝胶的选择与处理1.凝胶及柱的选择选择SephadexG100和1.5cm×60cm的柱子。2.凝胶的处理凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿