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1、血清P53-IgG抗体测定及其临床价值初步研究屮华检验医学杂志2000年第23卷第5期谢鑫友姜红英林洁费春荣摘要目的建立血淸P53蛋白IgG抗体（P53-IgG）酶免疫测定法，初步探讨其临床价值。方法以P53MoAb为包被抗体，以亲和层析纯化浓缩P53蛋白作为中介，自行建立了血清P53-IgG酶免疫测肚法。结果78例消化道癌P53-IgG阳性率34.62%（27/78）,而32名献血员和30例非癌住院患者均为阴性,P均V0.01o48例经免疫组化P53蛋白染色阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25%（27/48）,显著高于阴性对照组（0/
2、30）,P<0.01。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%,敏感度34.62%,阳性预测值100%,阴性预测值58.82%o本方法测定特异性100%,批内差异3.8%,批间差显16.2%。结论血清P53-IgG测定与P53蛋口表达相关，是P53基因研究的新的辅助指标之一。关键词：血清学诊断；酶联免疫吸附测定；P53抗体P53抑癌基因是研究最为深入的肿瘤相关基因之一，其与肿瘤产生、肿瘤生长调控I肿瘤细胞凋亡等关系密切。P53棊因表达与肿瘤浸润转移和复发潜能右关，P53基因蛋白（即P53蛋白）阳性的肿瘤预后不良。检测p53基因/蛋白对评价患者预
3、后和提高患者术后生存期限具重要价值。P53基因/蛋白检测以往仅限于手术切除肿瘤纽织的免疫纽织化学染色和DNA原位杂交。最近发现P53基I犬1/蛋白阳性肿瘤患者血清中存在特异性的抗P53蛋白抗体（P53・IgG）,P53-IgG测定可用于肿瘤转移，复发预测和P53表达动态观察，己引起了国内外学者的关注［1,2］。本研究向行建立了P53・IgG测定方法，并探讨其临床初步应用价值，现报道如下。材料和方法一、材料1.试剂：CNBr-Sepharose4B（Pharmacia公4，瑞典）,P53MoAb（MS-105,Clone:Pab1801,福州边
4、新生物技术公司进口分装），酯化生物素（美国Sigma公司），亲和素（上海丽珠东风试剂厂），免抗人IgG酶标抗体（丹麦Dako公司）。2.标本来源：血清标本130份，其中献血员32份，年龄23〜42岁；非癌住院患者30份（脑卒4份，肝硬化12份，高血床11份，消化性溃疡3份），年龄31〜64岁；消化道癌78份（胃癌62份,肝癌11份,大肠癌5份）,年龄48〜78岁。以上肿瘤均经手术,病理证实。所有标本经肘静脉取血3ml,新鲜分离血清，置-20°C保存，备川。二、方法1.P53蛋白粗制品的制备：收集数份经冰冻切片P53染色阳性胃癌纽织，仔细剔除正
5、常纽织、纤维，并剪成1mmXlmmXlmm,加入4倍体积的冰冷0.1mol/LTris盐酸缓冲液（内含0.1%苯磺酰氯,1.0%triton-100）高速匀桨，4°C搅拌过夜,次日再超声粉碎（0°C15sX8次）,10000r/min离心15min,子沉淀，上清液经生理盐水透析平衡［3］。另取预经对0.1mol/LNaHCO3透析平衡的P53MoAb1ml与IgCNBr-Sepharose4B按说明书交联，即为亲和层析柱，将上述肿瘤上淸液流穿此柱，经解吸后即可获P53粗制品。力II0.1%NaN3E2〜8°C保存。2.P53MoAb与酯化生物
6、索交联：同文献报道［4］。制备生物素化P53moAb置30%甘油2〜8°C保存。3.血清P53-IgG测定：将亲和素以1（）mg/L浓度包被微孔，4°C过夜，次口取出洗涤3次后，用10%小牛血清37°C封闭30min,洗涤2次，加入牛物素化MoAb50u1和50ul预经反应4°C过夜的血清・P53粗制品混合液（血清1:50,P53粗制品1:25,等量混匀）,混匀1niin,37°C反应60min,洗涤3〜5次，加入免抗人IgG酹标抗体，37°C反应60min,洗涤3〜5次，加四甲基联苯胺盐酸盐（TMB）底物避光显色10〜15min,以50u1
7、/?L2mol/L盐酸终止反应，以490nm测各孔A值。同时设立阴性及空白对照。阳性判断标准：凡大于献血员平均吸光度X+2.56S以上者为阳性。1.方法学质控：同一样本同次重复20孑L,计算批内差异，同一样本不同批次连续检测10次，计算批间差异。三、统计方法采用卡方检验。结果1.从近20g肿瘤组织中用亲和层析法分离P53粗制品420mg,用Western-Blot法鉴定内含数种杂蛋口，与P53MoAb呈强反应。2.不同疾患血淸P53-IgG阳性率测定结果表明献血员、非癌住院患者均无P53-IgG表达（0/32,0/30）,消化道肿患者P53-
8、IgG阳性率34.62%（27/78）,显著高于前两组，P值均＜0.01。血清P53-lgG测定的特异性100%,敏感性为34.62%o3.免疫组化染色P53阳性患
