系统化的LC方法开发策略小结

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1、一、系统性筛选策略—先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试评估结果，选择最有效的条件组合—再进行方法优化梯度/温度、影响选择性的主要因素1、固定相2、有机溶剂3、流动相pHImpacton%Improvem(ResolutioriDoubleN20-40%Doublek15-20%Doublea>400%

2、色谱柱小结：典型的C8和C18柱间分离选择性差异不大—在多数情况下，C8提供比C18弱的色谱保留，因此C8柱对非常疏水性的化合物来讲是个良好的选择—通常，使用C8柱还是C18柱视个人偏好-极性嵌入型固定相（RP8/RP

3、18柱）会赋予与C8/C18显著不同的分离选择性，对含酚羟基的多酚类化合物尤甚_苯基柱亦会赋予与C8/C18显著不同的分离选择性，对多环类芳香化合物尤为如此-构建在不同基体材料上色谱柱（例如硅胶柱和杂化颗粒柱）会呈现不同的分离选择性—方法开发需用考虑基体材料不同所带来的差别流动相溶剂小结：甲醇—氢键作用中的质子供给者—较低的洗脱强度一相对较高的柱压乙月青—氢键作用中的质子接受者—中等洗脱强度一粘度最低（柱反压最低）-作为最常使用的反相色谱洗脱溶剂，甲醇和乙睛经常呈现显著的分离选择性差异—若将两者混合可对分离选择性进行微调-同时改变色谱柱和流

4、动相溶剂通常可扩大分离选择性差异流动相pH小结：硅胶颗粒色谱柱pH范围：2〜8杂化颗粒色谱柱pH范围：1〜12对于含有有机酸和碱混合物的分离，流动相pH是最强大的分离选择性工具_当分析物间含有相近的pKa值时（例如全为有机酸或碱时），流动相溶剂和色谱固定相成为影响分离选择性的重要因素_流动相pH的选择对方法稳定性、耐用性具有重大影响，因此是方法开发中需要当作重中之重的因素进行关注的方面—切记，要取得最好的色谱保留与峰形：有机酸需要在低pH下分析有机碱需要在高pH下分析同时，要在分析物pKa+/-2范围之外进行方法开发，以提高方法的重现性和耐

5、用性使用PH12的磷酸盐缓冲体系进行方法开发时的注意事项：_中等pH尤其是高pH磷酸盐缓冲盐会腐蚀柱填料颗粒。PH12的磷酸盐缓冲液只有在绝对需要时，例如在进行低UV波长检测或者有机碱分析物的pKa大于10时，方才建议使用。_在通常的UV检测波长范围内（例254nm）,有许多对填料颗粒腐蚀性很小的高pH缓冲系统可供使用，包括碳酸氢鞍、三乙胺、氨水等都可方便地提供pH在9-11之间的良好缓冲能力-在绝对需要使用到PH12的磷酸盐缓冲液的场合，需要注意如下事项：—柱温务必保持在30oC以下—保持柱上缓冲液浓度在5to10mM之间—注意当流动相中

6、含有高组份的有机溶剂时，磷酸盐可能会在柱上和仪器管线内析出。可预先在烧杯内做流动相混合试验观察有无沉淀生成。一缓冲液一定要预先过滤—使用保护柱可增加分析柱的寿命进行LC方法开发前需要了解的信息:-样品的溶解度样品中待分析物的数目您需要分开多少个峰？_官能团；待分析物有怎样的差别?是否有可离子化的官能团？流动相pH值对色谱行为会有怎样的影响？-检测条件需要什么样的检测技术？什么检测器类型？-待分析物在样品中的浓度范围，定量要求-是否有基质干扰？方法开发的终极原则是在最短的色谱柱上完成最快的分离，以达致最高的样品通量和最省的流动相耗量。评估选择

7、时的考虑与步骤：浏览所得谱图，选择最佳组合。考虑：—分离所有的色谱峰还是主要分析成分而已？—对分离度的要求？—对峰拖尾因子的要求？—对色谱保留的要求？对峰流出方式的要求？（如希望杂质峰在前、主峰在后）一梯度分离还是等度分离方法？_步骤1:选择流动相pH-步骤2:选择色谱柱和流动相溶剂步骤3:对选定的最佳条件组合下的分离进行优化或微调一旦我们固定了pH,流动相组成和色谱柱，我们就可以对方法进行微调及优化_LC方法优化的参数—流速尤其是大分子物质—梯度较缓的梯度通常会提高分离度，但会降低灵敏度较陡的梯度通常会降低分离度，但会提高灵敏度对于难分离

8、物质组，需要使用窄梯度梯度改变可能会改变分离选择性—温度提高温度会降低流动相黏度，从而降低操作压力（保持流速恒定）温度改变也会造成分离选择性改变