小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定

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1、小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定作者：周晓彤沈振亚滕小梅夏漫辉【摘耍】日的探讨小鼠动脉血管内皮细胞分离、培养的方法，为进一步实验研究提供相应的技术手段。方法手术显微镜辅助下取小鼠主动脉，去除外膜及脂肪组织，将血管剪成1mmXlmm大小的组织块，用植块法在含20%胎牛血清的DMEM培养液中培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征，免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞VIII因子相关抗原(vonW订1ebrandfactor,vWF)鉴定。结果60h后，相差显微镜下可观察到内皮细胞从组织块边缘游出，12天左右细胞开始融合成片，免疫

2、染色相关抗原检测呈阳性。结论用组织块培养方法可以获取较为满意的小鼠血管内皮细胞。【关键词】小鼠血管内皮细胞原代培养Abstract：ObjectiveTodevelopeanefficientprotocolfortheisolationandcultureofvascularendothelialcellsfrommouseaorta.MethodsTheaortawasremovedfrommiceunderanoperationmicroscope,withtheperiadventitialfatandconnectiv

3、etissueclearedofcarefully.Thevesselwasopenedlongitudinallyandcutintosmall1mmX1mmcubes.Thecubeswereplacedonsix~we11plateswiththeintimasidedownandcoveredwithalittleDMEMcontaining20%fetalbovineserum・Thecellgrowthwasevidencedbyrevealingthemorphologicalcharacteristicsandi

4、mmunologicalmarkerVIIIfactor(orvonWillebrandfactor,vWF).ResultsEndothelialcellswerefoundmigrateoutoftheaorticcubeafter60h,formingconfluentmonolayerofacobblestonepatternwhenobservedunderinvertedphase-differeneemicroscopeabout12dayslater.Immunohistochemicallabelingshow

5、edthecharacteristicpositivereactiontovWFinthecytoplasmofthenewcells.ConclusionAreliablemethodisdescribedtoisolateandpropagatevascularendothelialcollsfrommouseaortabycultivatingsmalltissuecubes.Keywords:mice；vascularendothelialcells；culture在异种器官移植中，移植物血管内皮细胞是受体血流首先接触的

6、组织，也是受体抗体攻击的主要靶细胞［11在受体免疫系统作用下移植物血管内皮细胞激活，在自身损伤的同时也释放一系列细胞因子和黏附分子等，最终导致移植物失活［2］。因此，血管内皮细胞在异种移植排斥反应中起着重要的作用。我们利用植块培养的方法，成功地培养出小鼠血管内皮细胞并传代，为进一步研究血管内皮细胞的功能并探索有效的血管内皮细胞保护方法建立了可靠的技术平台。1材料和方法1.1实验材料体重20〜25g的昆明种小鼠（苏州大学实验动物中心），DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、Trypsin-EDTA（均为美国Gibco公司产品），En

7、VisionTM两步法试剂盒（上海基因科技有限公司），YZ20T-III手术显微镜（苏州医疗器械厂）、CA950-2超净工作台（上海净化仪器厂）、C02细胞培养箱（德国Heraeus公司）、EclipsTS100倒置相差显微镜（日本Nikon公司）。1.2实验方法1.2.1内皮细胞的分离和培养将小鼠颈椎脱臼处死，置入75%的乙醇中浸泡消毒1min,操作台铺无菌巾，将小鼠置操作台上并固定。胸腹正中切口逐层切开，显露整个胸腹腔，于脊柱左侧找到主动脉，10倍手术显微镜下解剖主动脉弓，于左锁骨下动脉远侧的主动脉壁上做一小切口，置入导引钢

8、丝直至骼动脉处，在钢丝引导下仔细分离动脉被膜及周围脂肪组织，切断其在胸腹腔的分支血管，完整取出胸、腹主动脉，并立即放入含DMEM培养液的培养1L1L中，移至超净工作台。在含有PBS液的无菌容器中反复冲洗血管3—4次，再放入另一无菌培养皿中，纵行剖开血管，用显微器