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1、产紫杉醇内生真菌060B1分离及鉴定摘要：从曼地亚红豆杉(Taxusxmedia)树皮内表皮中分离得到1株产紫杉醇的内生真菌060B1,并通过高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)分析其发酵产物，其紫杉醇产量为2.5〜3.0ug/g(紫杉醇/菌丝干重)，并通过形态学特征和18SrDNA序列分析，将其初步鉴定为毛霉属(Mucorsp.)真菌。关键词：红豆杉(Taxusxmedia)；紫杉醇；内生真菌；18SrDNA；毛霉(Mucorsp.)中图分类号：S459文献标识码：A文章编号：0439-8114(2012)23-5315-03IsolationandIdentificatio
2、nofATaxol-producingEndophyticFungus060B1ZHANGPengl,2,LIUBo2,XUMan2,AOMing-zhang2,FUChun-hua2,YULong-jiang2,GUYu-chengl(1.InstituteofIndustrialCrops,HubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430064,China；2.InstituteofResourceBiologyandBiotechnology,CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongUnivers
3、ityofScieneeandTechnology,Wuhan430074,China)Abstract：Ataxol-producingendophyticfungus060B1wasisolatedfromtheinnerbarkofTaxusxmedia.Itcouldproduce2.5〜3・0ugtaxolperonegramdryweightofmyceliumaccordingtodeterminationofhighperformanceliquidchromatography(HPLC)andmassspectrometry(MS)・Thefungus060B1wa
4、sdefinedasMucorsp.throughmorphologicalobservationand18SrDNAsequenceanalysis・Keywords：Taxusxmedia；taxol；endophyticfungi；18SrDNA；Mucor紫杉醇是最先分离自红豆杉的高效抗肿瘤药物［1,2］o但由于红豆杉资源稀缺，直接从红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足市场需求，利用微生物发酵法生产紫杉醇是解决紫杉醇药源紧缺问题的有效途径之一［3-6］。目前已有30多种产紫杉醇真菌被报道，但大多数真菌的紫杉醇产量都较低，无法进行工业化生产［3-5］o除了通过基因工程或诱变等手段提高
5、已发现的内生真菌的紫杉醇产量外，人们仍在积极地从自然界中筛选紫杉醇高产菌株。本研究从曼地亚红豆杉树皮内表皮中筛选得到1株产紫杉醇内生真菌060B1,并通过形态学观察和18SrDNA序列分析将其鉴定为毛霉属(Mucorsp.)真菌，为微生物发酵法生产紫杉醇提供了具有潜在应用价值的新菌株。1材料与方法1.1材料曼地亚红豆杉树皮样品采自华中科技大学校园苗圃。真菌分离及培养用培养基为PDA培养基(Potatodextroseagar)和PDL(Potatodextroseliquid)培养基，发酵培养基为YES培养基［7］。紫杉醇标样购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2试验方法
6、1.2.1内生真菌的分离与纯化内生真菌的分离和纯化参照已报道的方法［7,8］,经纯化后的内生真菌接种于PDA斜面保存于4°C冰箱。1.2.2紫杉醇的提取及HPLC-MS分析内生真菌紫杉醇的提取及高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)和质谱法(Massspectrum,MS)分析参照已建立的方法［7-9］oHPLC分析的色谱仪为Agilent1200HPLCSystemo质谱分析由华中科技大学分析测试中心完成,仪器为Agilent1100LC/MSDtrap。1.2.3真菌形态观察将内生真菌菌株于PDA斜面活化2〜3代后，接种
7、于PDA培养基平板，25-28°C培养2周，观察其菌落的形态特征和生长情况，包括菌落形状、生长速度、表面特征以及产生匏子体的能力等；并采用水浸制片法观察，即在载玻片上滴加1滴去离子水，用解剖针从平板上挑取少量带有胞子的菌丝，放入水滴中并轻轻用解剖针将菌丝分散，盖上盖玻片后，在显微镜下观察菌丝特征，包括菌丝体的粗细、有隔和分枝情况、颜色等，以及分生鞄子体的特征，如大小、性状、色泽等。1.2.418SrDNA序列分析将内生真菌接种在20mLPDL培养基中，28
