一株产紫杉醇罗汉松内生真菌的分离和鉴定

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1、ResearchPaper研究报告微生物学报ActaMicrobiologicaSinica48(5)：589~595;4May2008ISSN0001-6209;CN11-1995/Qhttp://journals.im.ac.cn一株产紫杉醇罗汉松内生真菌的分离和鉴定111,2*孙端方,冉雪琴,王嘉福12(贵州大学动物科学学院,农业生物工程省级重点实验室,贵阳550025)摘要：【目的】紫杉醇是重要的抗癌药物，主要从罗汉松等植物中提取，为了保护罗汉松等种质资源，本文从罗汉松植株中分离产紫杉醇内生真菌，并对内生真菌所产紫杉醇的抗肿瘤活性进行了分析。【

2、方法】采用组织块法自罗汉松的根、茎、叶等组织中分离内生真菌；通过四唑蓝（MethylThiazolylTetrazolium,MTT）比色法筛选有抗肿瘤活性的内生真菌菌株，通过薄层层析（ThinLayerChro-matography,TLC）和高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）对内生真菌所产活性物质进行鉴定；采用抽提法抽提内生真菌所产紫杉醇，应用Vero细胞对抽提的紫杉醇的活性进行了分析。【结果】从罗汉松属（Podocrapus）植物中分离到155株内生真菌，其中28株内生真菌具有较高的抑

3、癌活性。将其中一株菌株A2命名为EPTP-1，经形态学和分子分类学分析鉴定为烟曲霉（Aspergillusfumigatus）。菌株EPTP-1中抽提的紫杉醇5.553μg/L~555.3μg/L作用24h表现出明显的致细胞凋亡作用。菌株EPTP-1发酵5天时紫杉醇的产率为0.5578±0.0294mg/L。【结论】从罗汉松中分离到了一株产紫杉醇内生真菌EPTP-1，可作为紫杉醇类药物工业化生产的候选菌株。关键词：罗汉松；内生真菌；紫杉醇中图分类号：Q939文献标识码：A文章编号：0001-6209(2008)05-0589-07[7]植物内生真菌（E

4、ndophyticfungi）生活在植物体化学合成途径通常以紫杉醇的前体为原料，但合成内或一定阶段处于植物体内，包括菌根真菌和植物病过程的中间产物复杂且副作用不清楚，缺乏安全保[1]原菌；由于内生真菌与其宿主植物的长期共生，很障；近年来，出现了以植物细胞、或组织培养方法生[8]可能传递或吸收了遗传物质/酶，或者通过共进化获产紫杉醇，但由于培养条件严格难以规模化生产；[2]得了相似的基因，从而具有相同的合成次生代谢产因此通过微生物发酵方法生产紫杉醇具有远大的发物的能力。展前途，不仅能获得生理活性与植物来源一致的紫杉[3]紫杉醇（Taxo1）表现出广泛的抗

5、肿瘤活性，醇，同时还具有成本低、易于工业化生产等优点。[4]尤其对卵巢癌、乳腺癌、肝癌等具有显著的疗效。迄今，产紫杉醇内生真菌菌株主要从濒危物种红[5]1993年Stierle等首次从太平洋短叶红豆杉中分离豆杉科（Taxaceae）中分离，却忽略了与红豆杉亲缘到产紫杉醇内生真菌（Taxomycesandrenae）。目前，关系较近的三尖杉科（Cephalotaxaceae）、罗汉松科[9]紫杉醇的生产途径有4种：①从红豆杉组织中提取；（Podocarpaceae）等植物。罗汉松中含有紫杉醇及[10,11]②化学合成；③通过培养的植物细胞或愈伤组织获其同

6、系物、红杉醇、多种黄酮类物质，对人结肠取；④微生物发酵。第一种途径是现今临床药用紫杉癌细胞（HT-29）、肺癌细胞（A-549）、乳腺癌细胞[10]醇的主要生产方式，但红豆杉属于濒危植物，生长缓（mcF7）等肿瘤细胞株均有一定的抑制作用。同[6]慢，因此生产的成本高，也不利于红豆杉的保护；时，罗汉松在贵州、四川等多个省份境内分布，因此，基金项目:省长专项资金项目(黔省专合字2005-108号)*通讯作者。Tel:+86-851-3863510;Fax:+86-851-8298005;E-mail:jfwang@gzu.edu.cn作者简介:孙端方(19

7、87−),男,贵州省安顺人,硕士研究生,研究方向为微生物基因工程。E-mail:SunDFWolf@Yahoo.com.cn收稿日期:2007-11-02;修回日期:2008-02-06590DuanfangSunetal./ActaMicrobiologicaSinica(2008)48(5)从罗汉松类植物体内分离产紫杉醇内生真菌对紫杉的紫杉醇产物鉴定。醇类药物的生产具有重要意义。1.4产紫杉醇内生真菌的鉴定[14]1.4.1薄层层析（TLC）检测：参照文献方法进行。1材料和方法1.4.2高效液相（HPLC）分析：色谱条件：C18色1.1材料谱柱流动

8、相为磷酸（pH3.0）：乙腈=72：28（v/v）、1.1.1样品采集：罗汉松的根、茎、叶新鲜