性控冷冻精液的研究与应用

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性控冷冻精液的研究与应用王彦平，李艳华，朱玉林(北京奶牛中心)20世纪，人工授耕技术的推广应川使优秀种公牛的价值得到了充分利川，而超数排卵胚胎移植(MOET)技术的开发和应川使优秀母牛得以快速繁殖成为奶牛业的两次科技革命。1989年，Johnson等用流式细胞仪成功地分离了X和Y精子，开辟了奶牛业的第三次科技革命—性控精液。使用性控精液可以使奶牛所生后代中92%以上都是母犊，充分发挥泌乳这一雌性限性性状的潜能，大人提高牛群的扩繁速度。1性别控制技术性別控制是通过人为干预动物的正常生殖过程，使雌性动物按照人们的意愿生出所需性别后代的一种繁殖新技术。通过性别控制，不但可减少人类性连锁遗传疾病的发生，可挽救濒临灭绝的珍惜物种，而且可选择不同性别的家畜，满足畜牧生产的需要，有效利用性别控制技术将会大大提高畜牧牛产的经济利益。X、Y精子分离是性别控制最根本的技术手段，由秸子分离而衍生出了人工输精、体外受粘和秸子卵浆内注射三种可行的性别控制途径。1925年Lush最早根据X秸了和Y秸子密度差异的原理采川离心法分离兔了的X和Y粘子，但受精后出生后代的性别比例与对照组没冇显苦差异。之后采川的普通物理学分离法、免疫学分离法等仍处于试验阶段，缺乏可靠性和重复性。通过荧光原位杂交技术和流式细胞仪分离法是目前最具里复性、科学性和有效性的精子分离方法。2性控冷冻精液的研究采用流式细胞仪分离哺乳动物耕子的技术起源于20世纪70年代末80年代初。其基本原理根据X粘了和Y秸子DNA含量的差异，通过荧光染料与DNA结合，利川流式细胞分离仪对X和Y精子进行分离。经PCR分析、荧光原位杂交检测、流式细胞仪亜分析以及子宫内输精(IUI)、体外受精及胚胎移植(IVF.ET)和卵胞质内受精(ICSI)的结果证实，流式细胞仪分离精子技术是最具重复性、科学性和右效性的秸予分离方法。目前，牛、绵羊、猪和兔等的分离秸子结合Al、IVF-ET和1CSI等技术，已成功地产下了预期性别的后代；其中牛、猪、兔的分离秸子后代已经正常的繁殖出健廉的下一代。随着流式细胞仪分离耕子速率和准确性的不断提高、技术的不断改进，该技术将越来越广泛地运川予更多畜种的繁殖生产。2000年以来，随着精子分离速度的不断提高，XY精子分离技术逐渐进入商业化应用阶段。英国的Cogent公司是世界上第一家利川分离秸子技术投入生产的公司。直至2000年7月止，该公司已在其属下的162个农场进行了2000头牛的人工输精(AI),分离精子的平均怀孕率为52%,而非分离粘子对照组的为56%。美国XY公司从2000年开始性控耕液的商业化生产应用，至今已利用分离X精子冷冻秸液对10787头青年母牛进行了人工授秸，情期受胎率达到53%。墨西哥X、Y公司于2004年止式大量向市场提供良种奶牛的x精子冷冻精液，分离准确率都在90%以上，用x精子冷冻精液对青年母牛进行人工授精，情期受胎率保持在60%以上。我国奶牛性控粘液的实验研究工作起步较晚，但近年来发展迅速。2001年10月，黑龙江省大庆市山丰生物工程公司注册成立并率先进行粘液分离研究，2003年11月我国第一 头性控犊牛在该公司顺利诞生。2004年，内蒙古赛科星生物科技令限责任公司、天津XY种畜有限公司先后从美国引进粘子分离设备和技术，进行奶丫性控粘液的试验研究和规模化生产；与此同时，加拿大爱徳牛业发展集团、深圳澳西姆畜牧生物技术有限公司(代理销售美国GRI公司的性控冻精)等也开始向全国各地供应性控冻精。目前，国内利用性控冻精人工授精生产的母犊己有数万头。2.1性控精液分离速度随着人们对这一领域研究的不断深入，流式细胞仪分离技术不断改进，分离效率人幅度提高。1995年，每1000个精子通过流式细胞分离仪可产生20・40个分离纯化的精子，效率较低。Beltsville通过使川一•种新的使精子定向的管嘴形成了一种高速细胞分离技术，提高了精子的分离效率。H前，利用改良的高速流式细胞分离仪，在分离准确度保持相对稳定(90%左右)的前提下，每小时可分离X、Y精子个1100力个。与20整纪90年代初每小时只能分离X和Y精子各36万个相比，提高了30多倍，精子分离速率改辺•的进展见下表1。表1精子分离速率改进的进展年代精子分离速率(个/秒)1992-1997200-3001998-20001000-20002001-200430(X)-50002005—今5000-7000同时，流式细胞仪分离法可以获得准确度较高的单-•精子。例如，1993年，Cran等用此法分离牛精子后做体外受精试验，产下3头雄犊和3头雌犊，均与预测性别相符。1998年,Abeydeem等川该法分离猪楮子，X精子受精后产下23头雌性仔猪，性别准确率为97%；Y精子输精后全部产下雄性仔猪，性别准确率为100%。1999年，Seidel等将牛分离精子冷冻保存后受精，其后代性别准确率在90%以上。2.2性控冷冻精液的人工输精随着精子分离速度的加快，人工授精技术的不断改进、以及分离精子冷冻保存技术不断提高，液氮冷冻保存解冻后，90%以上精液样木的精子活率提高到了0.35以上，而冃分离冷冻的X和Y精子己经成功地应用于人工输楮、体外受精以及胞质内单精子显微注射等研究。Johnson等用流式细胞仪分离的兔X、Y精子进行人工授精试验，出牛后代性别统计结果,X精子授楮，后代94%是母兔；Y精子授楮，灰代81%是公兔。Johnson等(1991)对猪精液进行分离研究，使用新鲜的X精子对母猪进行人工输精，获得厉代母猪占74%。Huehanan^(2000)川低剂量(2500万)的分离马精于输入即将排卵的同侧子宫角顶端，获得57%的怀孕率。Seidel等(1999)报道他们在两年中使川了1370头青年母牛，其中1000头接受分离精子输精，370头为对照组。分离冻精组和对照组分别以1.0-3.0X106和20.0X106的输精剂量Al,65d时妊检,受胎率前者为51.89%(334/663),后者为64.47%(141/218),在配种后2个月内的流产率高于正常精液的1%・2%,所产犊牛准确率Y精子为90%,X精子为83%。流式细胞仪分离精子与其他繁殖技术相结合产下的首批预选性别后代见表2： 表2流式细胞仪分离精子与其他繁殖技术相结合产下的首批预选性别后代 表2-式细胞仪分离精子与其他繁殖技术相结合产下的首批预选性别后代受精方式分离精子的剂龟（xlO6）物种参考文献于术法人匸授箱（子宫）03兔『术法人匸授精（输卵骨）03猪体外受精lOrnl'1牛体外受粘OOO25/O.81M液前人m粘子胞质内注射—羊内窥镜人匸授精（子宫体）0.1羊深部人匸授精（子宫角）01-2.5牛体外受精—猪人匚授精（子宫）0.13人深部人工授梢（子宫角）25Johnson等(1989)Johnson(1991)Cran等(1993)Levinson、；(1995)Catt等(1996)Cran等(1997)Seidel鸽(1997)Rath等(1997)Fuecer(1998)Buchanan**i(2000)|2.3性控冷冻精液冷冻损伤的研究尽管牛的常规冻精在体外授精和人工输精等方血的运用已经非常普遍，但是性控冻精在这些领域的普及述存在一些问题，主要表现在性控冻精的授精能力低于常规冻精。Lu等（1999）进行的体外受精试验表明，分离冷冻精液的囊胚发育率要明显低于对照组。而在性控冻精和常规冻精人工输精的对比实验中，人多数研究结果表明，性控楮液输精后的奸娠率约为对照组的60%-80%,妊娠后1・2个月的流产率，性控精液比对照组高1%・2%。性控冻精授精能力的下降，与精子的活力和牛理机能在分离和冷冻过程受到的损害有关。流式细胞仪分离精子过程的一系列处理步骤，包括高度稀释、荧光染色、激光照射、分离加压已经离心处理等，均会对精子造成一定程度的损伤。王岭斌等（2010）也研究发现.性控精液的精子活力和顶体完整率显著低于常规精液.并冃精子超微结构有一定程度的顶体破裂及脱落等形态变化。在性控精液的分离过程中会用到Hoeehst33342荧光染料.并经过激光照射和一定电压的止电荷和电场辐射.以及80kin&的高速喷射从而分离X精子和Y精子。这些操作是否会对精子造成损伤、致畸或突变，需要进一步深入的研究。近年来，国外的研究人员对损伤机理展开了一些研究。Gamer等（2001）利用精子染色质结构分析法（SCSA）检测了流式细胞仪分离过程对精子DNA完整性的影响，结果表明：如果精子不染色、不进行激光照射只是通过流式细胞仪，分离精子的DNA完整率降低1.8%；如果只进行激光照射，不染色，则DNA完整率进一步降低2.0%；如果即染色又进行激光照射,则DNA损伤增加1.5%oGarner和Suh（2002）以及Seidel和Garner（2002）在评估流式细胞仪分离精子过程中分离加压对精子造成的损伤授大，精子活力下降18.6%； 在分离加压的同时进行激光照射，不进行染色，精子活力卜降25.4%。衣体外受精实验中，Lu等（1999）的研究结果表明，分离过程对种公牛精子受精斤的卵裂率没有显著影响，但分离组的囊胚发育率仅是对照组的70%o这些研究均表明分离过程会对精子造成伤害。目前国内对于分离、冷冻对精液损伤的研究述比较少，述没有对其形成进行完整的研究。冷冻损伤的研究对优化分离程序、完善冷冻程序及改进冷冻配方提供理论基础。3性控冷冻精液的应用：3.1性控冷冻精液的在加快奶牛扩繁速度应用常规冻精对奶牛进行人工授精产犊雌雄比例相当，这就延长了奶牛世代间隔，影响了奶牛的扩繁速度。而使川奶牛性控冻精对发情母牛进行配种町使受配怀孕母牛产母犊率达到90%以上，十分有效的降低了公犊岀生率，人人增加了母犊比例，提高了奶牛繁殖率。加上性控冻精为高效优质种公牛精液，配种选择优此高产奶牛。因此述可加快优质高产奶牛的繁育速度，发挥奶牛性别优势，提高奶牛品质，兹终达到提高奶牛产奶量的目的。使用性控精液.可以实现良种扩繁举例分析：假定第1年有100头可繁母牛，产犊间隔为1年，性控精液的母犊率为92%。后备牛的初配年龄为16月龄，所有待繁牛群的年繁殖率均为80%o使用性控精液理论上的扩繁效杲见表3。表3使用性控精液的理论扩繁效果分析100头可繁母牛常规精液（头）性控精液（头）多产母牛（头）提咼比例（％）1年后100+40=140100+80=1804028.62年后150+40=190180+80=2607036.83年后190+40=230260+80=34011047.84年后230+40+32=302340+80+59=4791775&65年后302+40+32=374479+80+59=61824465.26年后374+32+32=438618+59+59=7362986&0山表1可见，随着时间的延长，相比于常规精液.使用性控精液所产的母犊数越來越多提高的比例越来越大，优势越来越明显。按一头母牛犊2500元计算.第一年可以多创造10万元的价值：第2・6年分别为17.5万元、27.5万元、44.25万元、61.0万元和74.5万元再加上使用性控粕液带来的产奶等牛产性能的提商.经济效益更显著3.2性控精液在生产性控胚胎的应用使用性控粕液牛产性控胚胎用优秀的母牛做供体进行超排,使用性控精液配种，每次超排，可获得3〜5枚性控胚胎，进行同期发情和胚胎移植。该技术同时利用了优秀种子母牛和种公牛的优良遗传潜能，结合性控精液，生产性控胚胎，具有很大的技术优势为奶牛的良种扩繁提供了新途径。利用流式细胞分离仪准确分离梢液的成功，使得性控梢液在牛产中的应用成为可能。1=1前国内外已有部分作者对性控精液超排效果进行了报道，应用性控梢液对超排供体母牛进行2〜3次（3-4支细管）输秸，头均获得可用胚胎4.5枚。应用性控冻精对供体母牛（每头输粕4支）获平均可用胚数4.65枚（可用率为39.4%）,对照纽采用常规冻精（输精2支）获平均可用胚数6.1 枚（可用率为50.9%）。Sartori等研究结果农明应用性控精液获得可用胚胎数明显低于常规精液的可用胚胎数，使用X粘子的青年母牛的受粕率明显低于常规冻精组。30X106剂量的性控精液输精和常规精液输精在可用胚数上没有显著差别，Bodmer^对超排奶牛进行低剂量输粘（2X106有效精子），町用胚胎数人人降低，但退化胚胎数没有显著差别。据李建栋报道,采用子宫角与子宫体输精获可川胚数分别为7枚和4.2枚差异极显著。据Seidel报道采用低剂量（10・20丿j）性控精液鲜精进行输精，输精时根据卵巢上优势卵泡位置，采用同侧输精和异侧输精，结果两种输精方法的妊娠率没有差异。3.3性控精液在奶牛诱导双胎上的应用通过遗传选择、生殖激索、胚胎移植及营养调控等途径，人为地使单胎动物产双仔的技术，称为诱导双胎。牛是单胎动物冃繁殖周期长，应川诱导双胎技术，提高双胎率对成倍提高牛的繁殖力，增加后代数量，扩人商品牛群，相对减少基础母牛饲养费用，从而降低生产成本，提高养牛业经济效益。口本世纪30年代以来，国内外学者利用各种途径展开了对人工诱导母牛双胎的研究，尤其是近年来随着人们对母牛繁殖机理研究的深入和胚胎牛物技术的快速发展，人工诱导母牛双胎己成为可能。母牛怀双胎的最人不利影响是界性李生不孕。当母牛怀双胎时，随着两个胎盘的生长扩展常常相互融合。融合胎盘的部分血管吻合导致两胎儿间的血液相互流通，由于雄性胎儿的生殖腺发育早于雌性，其所分泌的激索通过吻合血管支迹人雌性胎儿的体内，抑制了雌性胎儿的卵巢皮质及生殖道的发育，导致母犊先天性不育。据Fujisllir等报道1451有92%的异性李生母犊不孕，使诱导双胎技术只能在肉牛生产中应用，而无法应用于奶牛生产。随着性别控制技术的发展，特别是性控精液的推广应用，将从根木上解决异性挛生不孕的问题，使诱导双胎技术在奶牛上应川成为可能，将成倍提高奶牛繁殖效率，双胎的其他不利影响可通过加强饲养管理得以部分解决。自然条件下，母牛所生后代中有一半是公犊.一半是母犊，相当于浪费了母牛一半的繁殖力。若推广使用性控精液，可大大提高母犊率（从50%提高到92%左右），实现迅速扩群.提高牛群体数量和养牛效益。性控冷冻精液应用于奶牛业将最大限地发挥良种牛的遗传、繁殖潜力，增加遗传和表型性别的选择强度，加快遗传进展。从而加快牛品种结构调整，捉高牛产效率利良种牛繁育速度。同时可显著捉高奶牛的牛产水平和奶农收入，大大促进中国乳业的发展。