牛精液冷冻损伤的研究进展

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牛精液冷冻损伤的研究进展王彦平张哓霞张海涛刘玉胡志刚(北京奶牛中心种公牛站，延庆基地102100)20世纪40年代，在奶牛牛产中首次成功地应用了人工授精技术，H前人工授精在世界奶牛中的应用回在90%以上。人工授精对于育种的重大意义在丁，借助它将优秀公畜的遗传物质通过冷冻，在时空上不受限制地传递到任何地方。随着人工授精技术的发展，精液冷冻技术逐渐成为畜牧养殖业最为有价值的技术和管理手段。精液冷冻技术高效利用了优秀种公畜个体的大量精子资源，极大的增加了遗传进展并提高了繁殖效率，减少了疾病的传播。该技术成为今天世界范围的现代化养牛业的基础。1776年意大利的Spallanzani首次观察到口然界的冰雪等低温物质对人类精子的彫响，直到英国的Polge和Parkes及Smith(1949)在保护剂中添加廿油的效果的发现，为现代精液保存技术和AI技术的发展奠定了基础。在随后的50多年中，冷冻精液技术发展I•分迅速，其在家畜动物、特种经济动物以及野生动物的繁殖和种子资源的保护中也得到极大的发挥。但ft到先在，精子冷冻自早期获得成功后，并没有获得根本性的改进。人们逐渐了解到冷冻解冻后的精子即使膜完整且活动正常，其功能明显与鲜精不同。如果冷冻解冻精子像鲜精一样使川，并获得较高的受胎率，就需要对稀释液配方甚至是冷冻技术进行较大的改进。在精液冻融过程中，精子的外周环境发牛了巨大的变化。即便使用优化的精液冷冻方案，仅―•部分精子能存活，在存活的这部分精子中也存在不同的功能损害。Watson(2000)在总结精子受精率与具备止常功能的活精子数的关系时认为：只有止常功能的精了数达到一定临界值时，精子的受精能力才能得到保证。根据此关系，只有提高冷冻精液中正常功能的活精子数H，方能使楮子库输出的精液质量得到提高。另一方面：也就是说，我们不仅要注意提高精子冻融后的存活率,更耍注意保护精子的功能。FertilityNumberofcompetentsperminseminated图1受精时精子数与受精相关曲线(Watson,2000)当精子细胞遭受冻融后，细胞内及细胞间形成冰品与冰晶融化是造成细胞损伤的原因之一。如果在低温保存组织过程中，需要在精液中加入冷冻保护剂，它们也口J对生物膜产生一•定的损伤,例如二甲亚矶对细胞有毒害作用，温度越高，毒害越大。这两个损伤因素均町使细胞的形态结构与功能发生改变，尤英对生物膜（如细胞膜，高尔基体膜，线粒体膜）的影响更为明显。细胞膜 上的膜蛋白变性，改变了膜脂和蛋白质之间的相互作用。膜的透性改变，钠离子和钾离子的透性加大，钾离子为钙离予发生置换，降低了膜的稳定性，细胞表面的电荷改变。质膜和细胞内的酶活性降低。线粒体膜破坏，氧化磷酸化偶联化解，能暈代谢紊乱，减少了能量供应。冰晶融化后大量水分又被吸入细胞，胞内为胞外充水，形成了缺氧的微坏境。最后导致生物膜的破损，细胞合成DNA、RNA和蛋口质的能力下降，表现出细胞的活力明显降低，最终细胞受损死亡。冻融后存活的精子也存在不同程度和不同类型的功能障碍，例如，冻融后部分精子出现获能样变化，顶体内容物排出，这种变化为真止在受精前获能与顶体反应是不同的，出现这种变化的冻融后精子可能存在受精功能障碍；冻融后精子的活动率明显下降；冻融后膜的完整性受损；冻融后膜蛋口出现聚集，影响膜受体•配体相结合；精子细胞核内携带的遗传物质在冻融后出现损伤，可能会引起胚胎早期死亡。1.质膜损伤精子中有不同形式的膜，如质膜、线粒体膜、顶体膜等，这些膜在精子形成和附睾修饰成熟过程屮，蛋口质和脂类发生不同的整合。膜的结构是由各种成分决定的，任何改变这种互相作川的过程都会改变它们的功能。温度可以通过影响膜构象来改变细胞的生物学特性。而H各部分质膜对冷冻的敏感性不同。粘了冻存时必须首先考虑各种不同的膜的结构和功能，生物膜对冻融有高度的敏感性，是细胞受到伤害的主要部位。低温对膜的伤害主要是形成的冰晶对膜造成挤压撕裂，从而造成机械损伤。山于水分大量结成冰晶，以致溶质浓度不断升高，产生盐害，使膜的结构遭受不可逆的变化。膜的选择透性改变，发生泄露现象。冷冻也可使蛋白质从膜上释放出来，甚至可达到膜蛋口总量的5%,同时伴有酶的释放和失活。在生物膜双分子层屮，每一层都有独特的脂类一蛋白质分布方式，并且均和膜功能有着潜在的关系，其至对冷冻复苏过程中出现的任何结构和排列变化有独特的敏感性。精子质膜完整性是精子能够新陈代谢，完成获能、顶体反应以及与透明带（ZP）结合并穿过ZP的基础。因此，精子质膜功能是否完整是区分粘子死活的一个重要特征。然而粘子质膜乂是粘子然而粘了质膜乂是粘子最易损伤的部位。II前检测粘子质膜的方法主要有3种：低渗肿胀试验法、常规染色法和荧光探针染色法。2.线粒体损伤线粒体是细胞内物质氧化和能量转换的场所，是细胞的“动力工厂”，牛成ATP的主要地点,细胞牛命活动所需能量的80%是由线粒体捉供的。线粒体将营养物质氧化成二氧化碳和水，同时释放ATP供能。线粒体结构和功能的改变将直接导致细胞不能止常物质代谢。精子线粒体位于精子尾部中段线粒体鞘内，围绕外周致密纤维呈紧密螺旋状排列。精子穿过宫颈粘液与子宫和输卵管内膜接触后，代谢活动明显增强，表明线粒体中氧化磷酸化产牛大量ATP,为精子顺利受精捉供能量。精子冻存后活力下降可能与线粒体受损和ATP合成障碍有关。在线粒体内、外膜交界处存在一种蛋白性孔道（permeabilitytransitionpore,PTP）。多种细胞死亡信号如Ca"超负荷、再灌注损伤等可造成PTP开启，引起线粒体膜电位崩解，呼吸链断裂，凋亡诱导因子（如细胞色素C）释放，激活Caspase酶，引起细胞凋亡和死亡。细胞膜电位是山于细胞膜两侧离子分如的不対称而产生的。细胞凋亡过程中常伴有线粒体膜电位的下降。，并口出现在核的变化之前。研究认为： 在低温、低氧等条件下能存活的细胞，是因为内部具有有效的ATP循环代谢耦联，使得在极端条件下ATP消耗的速度大大下降，远快于ATP合成速度的降低。而那些不能存活细胞中的ATP浓度下降超过了细胞的适应能力，造成不可逆损伤。在精子冻存实践中，公牛精子能很好的维持代谢耦联，而其他则不行。啮齿类动物精子冷冻闲难，与精子线粒体损伤有关。检测线粒体膜电位最常川的特异性探针是RhO123、D10C6和JC-1。DiOC6易与细胞内多不巾膜成分相结合，其结果易受细胞膜电位的影响。ifURhOI23在不同能杲状态下均能自山进出线粒体内膜，检测结果不可靠。JG1是一种碳鼠化合物类阳离子荧光染料，化学全称：5,5',6,6'-tetrachloro-1,I',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodideoJC-1nJ跨膜进入活细胞内定位在线粒体膜上。其聚集程度随线粒体膜电位升高而增加。JC・1,单体发射光527nm，呈绿色荧光：聚集体发射光590nm,呈红色荧光。JC-1特异性地与线粒体内膜结合，只在线粒体牍电位崩解时才释放出来。因此，检测结果可靠，敏感性更高。Gamer等应JIJJC-1成功检测到牛、马、猪精子线粒体膜电位的变化。1.精子获能和顶体反应的改变粘子必须在雌性生殖道内，经历一段成熟过程才能获得受粘能力，称为获能。一般获能的主要事件是除去或改变粘子质膜的稳定因了或保护物质使粘了质膜对卵更为敏感。体外受粘需要粘了体外获能，获能粘子穿过卵丘细胞外皋质时被激活引发顶体反应，释放水解的和磷酸酶，以穿过卵子卵丘细胞和透明带，最后与卵膜融合。用CTC（金霉素）顶体染色法，能客观定量地评价精子的获能和项体反应，冻融精子染色后在荧光显微镜下观察，AR型（即获能且发生顶体反应的粘子）增多。新鲜粘子体外受粘时，采粘后，粘子需要孵育1.5h左右使其获能后，再加入卵母细胞。而冻融粘了体外受粘时不需这个过程，冷冻复苏过程使粘子发生了类似获能的变化。冻融粘子体外受粘时可以见到足够数童的粘子围裹卵细胞，但是很多却不能受粘。这些变化的机理与对粘子受粘能力的影响还有待研究获能检测方法：精子获能过程中一个主要的事件是内流到精子细胞内。这种内流通常伴随粘子质膜成份改变和细胞内pH值升高，最终导致顶体反应。检测粘子获能的荧光染料是金霉素。金霉素法（Thechlortetracyclineassay,CTC）根据获能过程屮有Ca"内流的特点。CTC（金霧素法）能够进入细胞内包含髙水平Ca"的区间，能与C0结合。CTC-Ca2+复合物与细胞膜内的谎水区结合，荧光显微镜下激发萸绿色荧光，能够说明获能过程屮粘子各时期C/+短暂的变化和分布规律。粘子CTC染色类型主要有三种：①F型：整个粘子头部有均一荧光，为未获能，顶体完整的粘子；②B型：粘子头部顶体后区，在靠近尾部的部分无荧光或非常弱的荧光，而头前部为均一荧光，为获能H顶体完整的粘子；③AR型：整个粘子头部无荧光或非常弱的荧光，为顶体不完敕的精子，即发生了顶体反应的精子或顶体缺损的精子。所以，CTC不但可以检测精子获能的比例，还可以检测精子顶体反应的比例。目询CTCC经实际用于人猴、小鼠、山羊、马、猪、牛、等许多动物检测粘子的获能比例。目前检测顶体完整常川的方法是外源植物凝集素及一些与粘子内顶体抗原结合的抗体，其屮的外源植物凝集素常被川来评价顶体的状态。现在用的最多的是异硫氛荧光素（FITC）与豌豆凝集素（PSA）、花生凝集素（PNA）。FITC具有荧光性，而与其相连的凝集索能与顶体区的某些成分相互作用。用F1TC-PSA或F1TGPNA标记后，顶体完整的精子整个精子头部的顶体区衣现为 明亮的荧光，而发生顶体反应的精子则没有或只有赤道区有荧光标记。在荧光显微镜下可以淸楚的观察到顶体状态，也口J以用流式细胞计数仪检测，是目前较常用的检测精子顶体状态的方法。1.精子DNA损伤精子DNA大部分山核DNA构成，小部分为线粒体DNA。精子线粒体DNA是大小为16.5kb的环状DNA分子，由于线粒体DNA缺乏组蛋白和非组蛋白的保护，并H受氧化磷酸化所产生的活性氧类的损你所以其突变率远高于核DNAo线粒体DNA主要为母系遗传，但是研究表明也有少量的线粒体DNA为父系遗传。粘子活力与粘子屮部线粒体的容量有相关性，并且粘子线粒体DNA的改变可能导致精子活力低下。精子DNA损伤的特征性改变为精子DNA单链形成和双链断裂。在受精过程中和胚胎形成早期，卵母细胞和早期胚胎对损伤的精子DNA具有修复作用，所以粘子DNA损伤能否对后代产生影响取决于两者的共同结果。精子DNA损伤的检测方法:单细胞凝胶电泳（SCGE）,末端转移酶介导的dUTP末端标记法（TUNEL）、粘子染色体扩散实验（SCD）、荧光原位杂交（FISH）。2.精子运动性的检测运动能力是保证楮子在受精过程中，与卵子相遇和完成对卵膜的机械穿透作川，同时也是精子许多功能的一种综合直观的表现。通常精子的运动能力用精子活力（spermmotility）來评价，它是ft线运动精子数与精子总数的比例。有研究认为，活力的评定易受主观因素影响，因此活力对于精子潜在受精能力的评估并不是一个口J靠的指标。精子的运动能力虽然不能直接反映英受精能力，但精子的正常运动是牛理状态下完成受精过程的基础。楮子的运动性与受精能力存在相关，因此正确分析楮子的运动能力仍具有重要的意义。除了显微镜外，利用计算机辅助楮子分析仪（CASA）系统可以更详细对精子进行活率、活力以及其它运动参数进行检测。例如，精子总数,精子运动速度，直线运动精子数，曲线运动的楮子数，尾部摆动频率，头部侧摆幅度以及其他几种速度参数。研究发现，计算机辅助精子检测的精子活力、直线运动和密度与常规的光学显微镜检测结果高度相关。这种检测方法具有迅速、准确、車复性高等优点，可以在短时间内检测大量的精子。CASA系统的主要缺点是检测成本高和需要对系统进行标准化设置和校正，检测结果受精液稀释倍数、精液稀释液、检测时的温度和计数室等因素影响。通过对影响精子冷冻相关因素进行深入的研究，对不同动物楮液中理化性质的研究、楮子冷冻损伤的原因及温度、渗透床及氧化应激反应対精子膜的影响、不同动物种间及个体间精子膜分子组成结构（如构成膜的磷脂不宝盒程度的分子流动性间的差异是否与精子抗冻能力有直接的关系）、开发新的抗晶体形成保护剂以及膜保护剂等做了广泛的大量的研究，也取得了很大的进展。这方回也是以后研究精液冷冻保存的很車要的研究方向。