暴死的埃及塘虱病原菌的鉴定

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1、暴死的埃及塘虱病原菌的鉴定暴死的埃及塘虱病原菌的鉴定革胡子^(Clariasgariepinus)俗称埃及塘虱，上世纪80年代从埃及引入我国。该鱼肉质细嫩，具冇牛长速度快，耐低氧，适合高密度养殖等特点，已成为我国多个省市淡水养殖的巫要品种。近年來在革胡子鲍的养殖屮，疾病发生有逐年增多的趙势。对革胡子餘疾病的研究，国外已经报道的病原冇细菌及寄生虫，其中嗜水气单胞菌(Aero-monashydrophila)曾导致东南亚国家养殖革胡了绘暴发溃疡性流行性疾病，给当地养殖业造成了严重的经济损失。但是国内对革胡了鹼疾病研究尚未引起足够的重视，对

2、养殖中所发生的疾病种类、病因、病原的研究报道尚缺乏，导致养殖生产中对疾病防治缺少依据。2009年及2010年的11刀间，山东潍坊某养殖场养殖的革胡子鲍成龟进入越冬池后，发生急性出血性败血症，并导致暴发性死亡。该病传染性强、致死率高，给养殖生产带来极人的损失。为查明发病原因，本课题组对发病角进行了病因分析及病原的排查，対分离的可疑性病原进行了诗力验证及分类鉴定，并对分离菌株进行了药物敏感性分析，为该病防治提供理论依据。1材料和方法1.1材料患病革胡子鲍取自山东省潍坊市某淡水鱼养殖场,体长35〜40cm,均具有典型发病症平均体长15cm。

3、攻毒前暂h后的自来水，暂养7d状。人工感染用健康革胡子餘由潍坊某革胡子舱育苗场提供,养于水族箱中，水温为23〜24°C,养殖实验用水为曝气48适应环境后供感染实验川。1.2病症检查取具典型发病症状的革胡子鲍，检查鱼体形态、皮肤、鳍、鲍丝等部位出现的界常变化，取少量异常组织做水浸片镜检;解剖鱼体，检查其内脏器官，并切取少量组织做水浸片镜检，记录各异常症状。1.3病原菌的分离纯化取濒死病龟，用酒精棉球对龟体体表和腹部消薄后，用无菌注射器抽取病龟腹水，于LB平板划线分离;随后无菌解剖病鱼，剪取鲤、肝、肾、脾和腹部出血部位小块组织于无菌离心管

4、中，参照范文辉等的方法于LB平板上作细菌分离。将分离后细菌平板登于28°C恒温培养20h后，一80°C冰箱保存备用。1.4病原菌形态观察分离细菌划线接种于LB平板上，28°C培养18h后，按常规方法进行革兰氏染色和氧化酶试验，培养24h后观察菌落形态。1.5人工感染实验及细菌毒力分析实验菌在LB培养基上28°C纯化分离3次后，无菌生理盐水洗下菌落，稀释为2X108、2X107、2X106和2X105CFU/mL菌悬液。腹腔注射感染健康革胡子鲍鱼（0.1mL/尾），每组10尾，对照组注射等量生理盐水，每组设2个平行。感染后实验鱼置于水体

5、25L水箱养殖，水温23〜24°C,每天投饵及换水吸污一次，养殖观察14d,记录死亡鱼数，对死亡鱼进行解剖和病原菌再分离（方法同1.3）。实验结束后用Reed&Muench方法计算半致死剂量（LD50）。1.6病原菌的鉴定対目标菌株分别采用细菌全细胞脂肪酸鉴定系统（MTDT公司，美国）、Biolog微生物自动鉴定系统（Biolog公司，美国）及细菌16SrDNA序列分析3种方法进行鉴定。细菌全细胞脂肪酸提取参照宋红梅等［10］方法,应用SherlockMicrobialIdentificationSystem软件（MIDI公司，美国

6、）鉴定菌株。Bi-olog细菌鉴定按Biolog系统操作手册4.2版进行，简要过程为:细菌接种到鉴定板后30°C培养，分别于5h和20h用Biolog读数仪读数,用BiologGENlIIMicroStation软件鉴定菌株。细菌16SrDNA序列扩增按范文辉等的方法，PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成，测序结果经BLAST分析后，用Clustalx1.83软件与GenBank中相关菌株进行同源性比对,采用Mega4软件进行系统进化树建立、统计和聚类分析。1.7细菌药物敏感检测采用KB纸片扩散法：取LB平板28°C培养20h

7、菌落，无菌生理盐水制成1X108CFU/mL菌悬液，每平板加0.1mL涂布LB平板，贴放药敏纸片，28°C培养20h后测定抑菌圈直径。敏感度根据杭州微牛物试剂有限公司提供的标准进行判定。2结果2.1病症角塘中发病革胡子鹼浮丁-水囱，游动缓慢，病鱼下颌及鳍基部发红溃烂，严重者冇血流出，腹部及体侧有点状充血，肛门红肿外口，腹部膨大。解剖后可见病鱼肝脏呈土黄色；脾脏、肾脏明显肿大，失去原有弹性，组织易破碎；肠壁充血，腹腔内有人量含血的腹水，颜色暗红，粘稠度低。对鲍丝、溃烂皮狀、肝脏、脾脏、肾脏及肠道镜检，没有发现寄生虫。2.2病原菌结果分离

8、从患病革胡子聽肝、肾及腹腔积水中分离到优势度在80%以上病原菌一株，分离株在LB培养基菌落为圆形、边缘整齐光滑、屮央凸起，灰门色，有光泽，直径约1.5mm0菌体革兰氏染色为阴性，短杆状，氧化酶反应阳性。该菌株编号2010