酶学分析技术

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1、酶学分析技术1酶的活性是指酶的催化能力的大小，即酶促反应速度的快慢。在规定条件下，单位时间内底物减少的量或产物生成的量来表示。2酶活性的单位是指在特定的条件下，使酶促反应达到某一速度所需要的酶量。31.惯用单位由方法的作者自己规定在某特定条件下生成一定量的产物为一个单位。2.国际单位（IU）在规定的实验条件下，每分钟催化1µmol底物发生反应的酶量。3.Katal1Katal是指在最适宜的条件下，每秒钟催化1mol底物发生反应的酶量。4酶的比活性是指单位质量（mg）的蛋白质所具有某种酶的活性。活性单位/mg蛋白比活性是衡量酶纯度的一个指标。5酶活性单位的计算酶单位/升=（A测

2、-A对）.V总.106K.L.V标×规定保温时间实际保温时间6酶促反应进程曲线产物浓度反应时间t线性期(B)偏离线性期（c）7Vm[S]Vm/2Km一级反应混合级反应零级反应酶促反应底物动力学8Vmax[S]米-孟氏方程式：V=Km+[S]当酶促反应υ=1/2Vmax时，Km值是酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mmol/L。Km值是酶的特征常数之一。91.v=V[S]/Km+[S]2.Km=[S](V/v-1)3.Km在一定的底物、pH、温度下是一个常数(种类及底物性质有关)4.酶促反应∝亲和力∝1/Km6.设计适宜的底物浓度10-20Km5.选择酶的最适底物1

3、0Km和Vmax的测定(双倒数法)1Km+[S]Km11==vVmax[S]Vmax[S].+Vmax111[S]1VVmax1斜率=VmaxKm-Km1双倒数作图法12酶活性测定的方法1.终点法（又称二点法、固定时间法）酶促反应一定时间后（从t1到t2)终止酶促反应，然后测定产物生成的量或底物消耗的量。13优点酶促反应已终止，比色计无需恒温装置，不必考虑显色剂对酶的影响。缺点无法了解酶作用这段时间里反应是否外于线性期。14每隔一定时间（10～60秒）连续测定酶促反应中某一产物或底物变化量称为连续监测法。优点容易找到线性期、结果可靠、省时、省试剂、省样品缺点反应速度易受温度、pH、

4、底物浓度等因素的影响。2.连续监测法（又称速率法）15酶学分析是将酶作为试剂的一种分析技术，它包括：1.借助酶来测定某化合物2.借助酶来测定另一种酶特点：专一高效灵敏温和工具酶16在许多酶促反应中，底物或产物的变化量很难直接测定，常需要在反应体系中加入一种或一种以上的酶作为试剂。使第一个酶促反应的产物转变为易于检测的第二个酶或第三个酶的底物，通过这种偶联反应间接测定第一个酶的待测物浓度或待测酶的活性，这种作为试剂用的酶称为工具酶。ABCP17酶偶联测定法ABCPEXEaEiLDH、MDH、G6PD、GLDH作工具酶均是以NAD（P）H为辅酶的脱氢酶。P+NAD(P)H+H+

5、PH2+NAD(P)+18将水溶性的酶，通过物理或化学的方法，使其吸附、包埋或共价结合在固相载体上，成为不溶于水但仍保留催化活性的酶的衍生物称为固相酶。优点：可反复使用机械强度大稳定性好抗干扰性强19名称室温4℃-20℃乳酸脱氢酶7730天冬氨酸氨基转移酶21430丙氨酸氨基转移酶21430肌酸激酶0.30.62碱性磷酸酶0.56600淀粉酶26060几种酶的稳定性（天）20同工酶的产生机理不同基因位点编码等位基因编码多条肽链化学修饰产生21电泳法层析法免疫化学法动力学法热失活法同工酶的分离及鉴定2223血浆酶的来源血浆特异的酶凝血酶类、纤溶酶类外分泌的酶淀

6、粉酶类、脂肪酶类、碱性磷酸酶类细胞内酶ALT、AST、LDH24酶活性测定在临床诊断中的应用在肝脏疾病诊断中的应用ALT、AST、LCAT、OCT、ICD、GLDH、SDH、5’-NT、γ-GT、ALP、MAO特异性强、活性高的酶在急性心肌梗死诊断中的应用AST、LDH、CK（心肌酶）在急性胰腺炎诊断中的应用淀粉酶和脂肪酶25在骨骼疾病诊断中的应用ALP在肌肉疾病诊断中的应用AST、CK、LDH、ALD在前列腺疾病诊断中的应用ACP在肿瘤诊断中的应用26（一）样品1.溶血2.抗凝剂3.样品存放的时间和温度（二）测定条件1.温度2.pH3.缓冲液的性质影响酶活性测定的因素27