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1、第七章酶学分析技术机体各种物质的代谢都是在酶的催化卜•完成的，酶的编码基因突变或表达界常，可导致酶分子缺陷，使代谢障碍，引起疾病；同样组织细胞的病变，也可导致酶活性的改变，因此酶学分析在临床诊断中具有重要意义。第一节酶活性测定的基本知识酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质，它在体含量极微，每ml仅为pg水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，称为相同对定量法。一、酶活性的概念酶活性是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即酶反应的速度。如果在酶反应过程中测得的产物[P
2、或底物[S]的变化量对时间作图，可得到酶促反应时间进行曲线
3、。反应最新阶段，[S]过量，原始浓度很大。[門或[SI的变化量随反应时间而线性地增减，即单位时间内[P]或[S]的变化量或反应速度是恒眾的，此阶段称为零级反应期。v=_d[Sl=d
4、Pl=dtdt0其反应速度S)与[SJ.[PJ无关，而以恒速进行。即-d[S]=KodtJS]ti积分Jd[S]=KofdtJ
5、S1OJ0得[S]0-[S]l=K<)t以[S]0-[S]t对t作图可得一直线，其斜率为Ko,实际上[S]°—[Sh也就是t时产物[P]，故[P]和反应时间成正比,[P]=Koto一般情况下，产物和底物的变化量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，因产物是从
6、无到有，只要测定方法足够灵敏，准确度很高。二、酶活性单位酶活性大小通常以单位來表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，酶单位有三种表示方式。1.惯用单位60年代前，各种酶活力的表示法和酶单位定义没有统一标准,一般由方法的设计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产物为一个单位。这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不同单位定义，如ALT的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位是定义不同，正常参考范围也不同。King法：每100ml血清在37°C与底物作用60mim,每生成1umol内酮酸为一个酶活性单位。Moh
7、um法：1ml血淸37°C与底物作用60mim每产生5ug丙酮酸为一个酶活性单位。Reitmen法套用Karman单位，在规定条件下（血清1ml,反应液总量3ml,25°C,作用lmin,内径lcm比色杯）测定340nm波长处，吸光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。1.国际单位1961年国际生化学会酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU）是指在规定条件b（如25°C,最适pH,最适⑸时）每分钟催化1umol底物发生反应的酶量。1965年改为30°C,1972年取消时温度的规定。缺点：1）由惯用单位换算成IU较麻烦2）对分子量不明的底物无法计算其摩尔浓度。3）同一种
8、酶用不同的测定方法，换算成国际单位后仍不相同。2.Ratal单位1972年国际猶学委员会又提出的一种新单位，是指在最适条件下，每秒钟催化1mol底物发生变化的酶量。1Kat=60X106IU1nKat=0.061U1IU=16.67nKat三、酶活性单位的计算酶活性单位的计算，实际上就是计算单位时间内底物或产物的变化量。计算方式酶单伫/升二产物生成量、,每一单位规定的保温时间、，1000（ml）二每一单位规定的产物生成量％实际保温时间%实际样品用量（mi）如：血清淀粉酶测定（碘比色法）缓冲淀粉液，0.4g/L,用量1.0ml,血清0.02mlo单位定义100ml血清37°C
9、,作用15mim每水解5mg淀粉为一个淀粉酶单位。淀粉酶单位/升=人对照—A测定％21x丄丄x型9A灿照5.07.50.02女fh已知产物或底物的吸光系数，可用卜•式计算：终点法：酶单位/升=（A测定一A对照）x每单位规定保温时间x实际保温时间106XE-L速率法:IU/L=AA/minxVrx10VssL如ALT测定速度法，NADH在340nm的摩尔吸光系数为6300,反应液（工作液）1.0ml,血清0.1ml,光径lcm。ALT(IU/L)=AA/minx—x——=AA/minx17461.16300x1四、酶促反应底物动力学（-）米一曼方程酶的活性除了受温度pH,抑制
10、剂，激活剂等因索的影响外，还受底物浓度的彩响，1913年Michaelis-Menten根据酶作用的屮间产物学说，定量地分析了酶反应速度与底物浓度的关系，其数学表达式为:VmaxfS]V=Km+[S]Km是3个速度常数的复合函数，在数值上相当于反应速度为最人速度一半时的底物浓度。当v=—Vmax2Vmax_Vmax[S]2_Km+[S]Km=[SJKm可表示酶与底物的亲和力，Km越大，表示E与S的亲和力越小反应，Km越小表示iW与S的亲和力越大。Km是酶的特征性常数2—，只与酶的结构底物性质以及反应条件（如温度、P
